በፒተር ሳርኖው፣ በስታንፎርድ ዩኒቨርሲቲ የሕክምና ትምህርት ቤት፣ ስታንፎርድ ዩኒቨርሲቲ፣ ካሊፎርኒያ፣ ታኅሣሥ 25፣ 2020 ጸድቋል (ጥቅምት 25፣ 2020 የተገመገመ)
ለመባዛት እና ለዝግመተ ለውጥ ጥበቃ አስፈላጊ የሆኑትን ኮሮናቫይረስ-የጽሑፍ ግልባጭ ውስብስቦችን በማባዛት በንዑስ ክፍሎች መካከል ያለውን መስተጋብር ሪፖርት እናደርጋለን።ከnsp12 ጋር የተያያዘው የኒራን ጎራ በትራንስ ውስጥ nucleoside monophosphate (NMP) transferase እንቅስቃሴ እንዳለው እና nsp9 (አር ኤን ኤ ማሰሪያ ፕሮቲን) እንደ ኢላማው ለይተናል የሚል ማስረጃ አቅርበናል።ኒራን በMn2+ ions እና በአጎራባች በተጠበቁ የአስነን ቅሪቶች ላይ በሚታመን ምላሽ የNMP አካልን ከተጠበቀው nsp9 አሚኖ ተርሚነስ ጋር ያለውን ትስስር ያበረታታል።የኒራን እንቅስቃሴ እና nsp9 NMPylation ለኮሮና ቫይረስ መባዛት አስፈላጊ እንደሆኑ ታወቀ።መረጃው ይህንን የጎጆ ቫይረስ ኢንዛይም ማርክን እንቅስቃሴ በአር ኤን ኤ ቫይረሶች ክፍል ውስጥ የአር ኤን ኤ ውህደት መጀመሩ ተግባራዊ እና በዝግመተ ለውጥ ወጥነት ያለው ነው በሚል መላምት ከቀደምት ምልከታዎች ጋር እንድናገናኝ ያስችለናል።
የኒዶቪራሌስ (Coronaviridae, Arterioviridae እና 12 ሌሎች ቤተሰቦች) በአር ኤን ኤ ላይ የተመሰረተ አር ኤን ኤ ፖሊሜሬሴ (RdRps) ከአሚኖ-ተርሚናል (N-terminal) ጎራ ጋር የተገናኘ ነው ከ polyprotein የተለቀቀው ኒራን ተብሎ የሚጠራው መዋቅራዊ ያልሆነ ፕሮቲን (nsp) 1ab በቫይረስ ዋና ፕሮቲሊስ (Mpro) የተዋቀረ ነው።ከዚህ ቀደም የደም ወሳጅ ቫይረስ NiRAN-RdRp nsp የራሱ የጂኤምፒየሌሽን/UMPylation እንቅስቃሴ ሪፖርት ተደርጓል፣ እና ኑክሊዮሳይድ ሞኖፎስፌት (ኤንኤምፒ) ወደ (በአሁኑ ጊዜ የማይታወቅ) ቫይረስ እና/ወይም የሕዋስ ባዮፖሊሜራይዜሽን ነገሮች ለማዘዋወር አላፊ ጊዜ ለመፍጠር ተጠቁሟል።እዚህ ፣ እኛ ኮሮናቫይረስ (የሰው ኮሮናቫይረስ [ኤችኮቪ] -229E እና ከባድ አጣዳፊ የመተንፈሻ አካላት ኮሮናቫይረስ 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) Mn2 + ጥገኛ NMPylation እንቅስቃሴ እንዳለው እናሳያለን ፣ ይህም ከ nsp9 በ Mpro-mediated nsp9 ምስረታ ነው ። የ N-terminal flanking nsps በፕሮቲዮቲክስ ይለቀቃል፣ ፎስፎራሚዳይት ከዋናው አሚን (N3825) ጋር በ N-terminal of nsp9 ተጣብቋል።በዚህ ምላሽ ውስጥ ዩሪዲን ትሪፎስፌት ተመራጭ ኑክሊዮታይድ ነው፣ ነገር ግን አዴኖሲን ትሪፎስፌት፣ ጓኖዚን ትሪፎስፌት እና ሳይቲዲን ትራይፎስፌት እንዲሁ ተስማሚ ተባባሪዎች ናቸው።ሚውቴሽን ጥናቶች recombinant coronavirus nsp9 እና nsp12 ፕሮቲኖች እና ዘረመል ምሕንድስና HCoV-229E ሚውቴሽን በመጠቀም ኒRAN-መካከለኛ nsp9 NMPylation እና ሴል ባህል ውስጥ ቫይረስ መባዛት አስፈላጊ ቀሪዎች ወስነዋል.መረጃው የኒራን አክቲቭ ሳይት ቅሪቶች ትንበያን አረጋግጧል እና የ nsp9 N3826 ቅሪቶች በ nsp9 NMPylation እና የቫይረስ ማባዛት በብልቃጥ ውስጥ ያለውን ጠቃሚ ሚና ወስኗል።ይህ ቅሪት የተጠበቀው N-terminal NNE tripeptide ቅደም ተከተል አካል ነው እና በኮሮና ቫይረስ ቤተሰብ ውስጥ ብቸኛው የማይለዋወጥ የnsp9 እና የእሱ ግብረ ሰዶማዊ ቅሪት መሆኑን አረጋግጧል።ይህ ጥናት NMPylation ሌሎች የጎጆ ቫይረሶች ተግባራዊ ጥናት የሚሆን ጠንካራ መሠረት ይሰጣል እና ፀረ-ቫይረስ መድኃኒቶች ልማት በተቻለ ዒላማዎች ሃሳብ.
ኒዶቪራሌስ ፖዘቲቭ-ክሩድ አር ኤን ኤ ቫይረስ የተለያዩ የጀርባ አጥንቶችን እና የጀርባ አጥንቶችን (1, 2) ይጎዳል.ትዕዛዙ በአሁኑ ጊዜ 14 ቤተሰቦችን (3) ያካትታል ከነዚህም ውስጥ የኮሮናቫይረስ ቤተሰብ ባለፉት 20 ዓመታት ውስጥ በስፋት ጥናት ተደርጎበታል።በዚያን ጊዜ ሦስት የዞኖቲክ ኮሮና ቫይረስ ከእንስሳት አስተናጋጆች ወጥተው በሰዎች ላይ ከባድ የመተንፈሻ አካላት ወረርሽኝ አስከትለዋል።በከባድ አጣዳፊ ተላላፊ በሽታዎች ሳቢያ የማያቋርጥ ወረርሽኞችን ጨምሮ።የመተንፈሻ አካላት ኮሮናቫይረስ 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7)።ኒዶቫይረሰሶች አንድ የጋራ የጂኖም ድርጅት ይጋራሉ፣ እና የሜምፕል-ታንድ ማባዛት-ጽሑፍ ኮምፕሌክስ (RTC) ንዑስ ክፍል በ5-?²-ተርሚናል ሁለት ሦስተኛ እና የቫይረስ ቅንጣት ዋና መዋቅራዊ ንዑስ ክፍል እና እንዲሁም አንዳንድ መለዋወጫዎች ውስጥ ተቀምጧል። .ፕሮቲን፣ በጂኖም (1) 3??² መጨረሻ ሶስተኛው ውስጥ የተቀመጠ።ከአንድ ቤተሰብ የፕላኔሪያን ቫይረሶች (Monoviridae) (8) በስተቀር ሁሉም የጎጆ ቫይረሶች የ RTC ንዑስ ክፍሎችን በሁለት ትላልቅ ክፍት የንባብ ክፈፎች (ORF) ORF1a እና ORF1b ያመለክታሉ፣ እነዚህም ከጂኖሚክ አር ኤን ኤ የተተረጎሙ።ORF1a የ polyproteinን (pp) 1aን፣ እና ORF1a እና ORF1bን በአንድነት pp1abን ይመሰርታል።በ ORF1a የተመሰከረው የዋናው ፕሮቲሊስ (Mpro) አጠቃላይ ተሳትፎ ሁለቱም pp1a እና pp1ab በፕሮቲዮቲክስ ወደ ተለያዩ መዋቅራዊ ያልሆኑ ፕሮቲኖች (nsps) እንዲሁም 3CLpro በመባልም ይታወቃሉ። 9)እነዚህ ኤንኤስፒኤስ ወደ ትልቅ ተለዋዋጭ RTC ተሰብስበው የጂኖሚክ አር ኤን ኤ (ማባዛት) ውህደትን እና የንዑስ ጂኖሚክ አር ኤን ኤ ስብስብን (ግልባጭ) ያዘጋጃሉ እና በ ORF1b (10?) የታችኛው ተፋሰስ የሚገኘውን የ ORF አገላለጽ ለማስተባበር ያገለግላሉ። ?12)።
ኮር RTC በአር ኤን ኤ ላይ የተመሰረተ አር ኤን ኤ ፖሊመሬሴ (RdRp) (13)፣ ሱፐርፋሚሊ 1 ሄሊኬዝ (HEL1) (14፣ 15) እና በርካታ አር ኤን ኤ ማቀነባበሪያ ኢንዛይሞችን ያጠቃልላል፣ እነዚህም በዋናነት በ ORF1b እና በኮሮና ቫይረስ ቤተሰብ ውስጥ ተቀምጠዋል Nsp12-nsp16 እና nsp9-nsp12 በ Arterioviridae ቤተሰብ ውስጥ (ማጣቀሻ 10ââ 12 ይመልከቱ)።RdRp እና HEL1 ሁለት (አንድ አምስተኛ) የተጠበቁ የወፍ ጎጆ ቫይረስ ጎራዎችን ይወክላሉ እና ከሌሎች አር ኤን ኤ ቫይረሶች መካከል ግብረ-ሰዶማዊነት አላቸው።ኮር ማባዛት በሌሎች ንዑስ ክፍሎች እንደሚታገዝ ይታመናል፣ ከካርቦክሲ-ተርሚናል (ሲ-ተርሚናል) የ pp1a ክልል፣ ከ Mpro (ኮሮና ቫይረስ nsp5 እና ደም ወሳጅ ቫይረስ nsp4፣ በቅደም ተከተል) የተለቀቁትን ጨምሮ።የተወሰነ ቤተሰብ-ተኮር ጥበቃ እና የተለያዩ እንቅስቃሴዎች አሏቸው (በማጣቀሻ 10ââ12 የተገመገመ)።
በአንፃራዊነት በቅርብ ጊዜ፣ በሁሉም የጎጆ ቫይረሶች ውስጥ ከRdRp አጠገብ ባለው አሚኖ ተርሚነስ (N-terminus) ላይ ልዩ የሆነ ተከታታይ ሞቲፍ ባህሪ ያለው ጎራ ተገኝቷል፣ ነገር ግን ሌላ አር ኤን ኤ ቫይረስ የለም (16)።በቦታው እና በኑክሊዮታይድ ዝውውር (Nucleoside monophosphate [NMP] transferase) እንቅስቃሴ ላይ በመመስረት ይህ ጎራ NiRAN (Nestvirus RdRp-related nucleotide transferase) ይባላል።የNiRAN-RdRp ድርብ-ጎራ ጥምረት በCoronaviridae ቤተሰብ ውስጥ nsp12 እና nsp9 በአርቴሪዮቪሪዳe ቤተሰብ ውስጥ እና በሌሎች ኔስቶቪሪዳኢ ውስጥ NiRAN-RdRp ከቫይራል ፕሮቲን ፕሮቲን ነፃ የሆነ nsp ይለቀቃል ተብሎ ይጠበቃል።በኮሮና ቫይረስ ውስጥ፣ የኒራን ጎራ ??1/450 ቅሪቶችን ይይዛል እና ከC-terminal RdRp ጎራ በአገናኝ ክልል (16?19) የተገናኘ ነው።በ Equine Arteritis Virus (EAV) (Arteriviridae) ውስጥ, recombinant nsp9 Mn2+ ion-dependent (self) UMPylation እና GMPylation እንቅስቃሴዎችን ያሳያል, ይህም በ nestovirus, AN, BN እና CN ውስጥ ባሉት ሶስት የተጠበቁ ቅደም ተከተሎች ላይ የተመሰረተ ነው.N ኒራንን የሚያመለክትበት ቦታ) (16)።የእነዚህ ጭብጦች N-terminal ጎን ለጎን ወግ አጥባቂ ቅድመ-ዝንባሌ ነው።ከእነዚህ ቅሪቶች መካከል የተወሰኑት ከርቀት ጋር በተያያዙ የፕሮቲን ኪናሴስ ውስጥ ተጠብቀው ይገኛሉ፣እዚያም በኑክሊዮሳይድ ትሪፎስፌት (NTP) ማሰሪያ እና ካታሊቲክ እንቅስቃሴ (20፣ 21) ውስጥ እንደሚሳተፉ ታይቷል።ከዚህ ምልከታ ጋር በተጣጣመ መልኩ፣ በpseudokinase SelO ውስጥ የሚገኙ በርካታ ቁልፍ ንቁ የሳይት ቅሪቶች ከፒሴዶሞናስ ሲሪንጋ በቅርቡ ከታተመው SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 ሱፐር ኮምፕሌክስ ጋር ሊገጣጠም ይችላል።የተጠበቁ የኮሮና ቫይረስ የኒራን ቅሪቶች በኤሌክትሮን ማይክሮስትራክቸር ላይ ተደራርበው ይገኛሉ።ድጋሚ ፕሮቲን (17).የሰነድ (ራስ) U/GMPylation ኤንኤምፒን ወደ (በአሁኑ ጊዜ የማይታወቅ) ንኡስ ክፍል (16) እና በኒራን እና ፕሮቲን ኪናሴ መካከል ያለው መዋቅራዊ ተመሳሳይነት (17፣ 19)) ለማስተላለፍ ጊዜያዊ ሁኔታን እንደሚያመጣ ተገምቷል። ኒራን ሌሎች ፕሮቲኖችን ይቀይራል።
ብዙ ባህሪያት፣ ልዩ እና ልዩ የሆነ ስልታዊ ትስስር ከጎጆ ቫይረሶች ጋር እና ከ RdRp ዘረመል መለያየትን ጨምሮ፣ ኒራን ለተፈጠሩ ቫይረሶች መፈጠር እና ማንነታቸው ወሳኝ የሆነ ምክንያታዊ ቁልፍ የቁጥጥር ኢንዛይም ያደርጉታል።ከዚህ ቀደም ጂኖም/ንዑስ ጂኖሚክ ትርጉምን ወይም ማባዛትን/ ግልባጭን ለመቆጣጠር ኒራንን የሚያካትቱ ሦስት ሊሆኑ የሚችሉ ተግባራት ተጠርተዋል።በወቅቱ ያለውን ውስን እና ያልተሟላ መረጃ ግምት ውስጥ በማስገባት እያንዳንዱ ተግባር ጥቅሞቹ እና ጉዳቶቹ አሉት (16)።በዚህ ጥናት ውስጥ ሁለቱን ዝርያዎች የሚወክሉትን የኮሮና ቫይረስ ባዮኬሚካላዊ እና የተገላቢጦሽ የዘረመል ጥናቶችን በማጣመር ግኝቶቻችንን በዝግመተ ለውጥ ዳራ ላይ በማድረግ የኮሮና ቫይረስ ቤተሰብን በዚህ ሚስጥራዊ ግዛት ውስጥ ግንዛቤ ለማግኘት እንፈልጋለን።በRTC ውስጥ የተፈጥሮ ኢላማዎችን በመለየት የኒራንን ግንዛቤ ዋና መሻሻሎችን እናቀርባለን።ይህ ጥናት በቫይረሱ አስተናጋጅ በይነገጽ ላይ ለሌሎች የኒራን ሚናዎችም እድሎችን ይከፍታል።
የኮሮና ቫይረስ nsp12 ተዛማጅ የኒራን ዶሜይን ኢንዛይማቲክ ባህሪያትን ለመለየት በ ኢ. ኮላይ ውስጥ የሰው ኮሮናቫይረስ 229E (ኤችኮቪ-229ኢ) nsp12 በሂስ 6 መለያ በ C-terminus እና በማጣመር ከ[α32-P] ጋር ፕሮቲን ከኤንቲፒ ጋር በ MnCl2 ፊት በማቴሪያሎች እና ዘዴዎች ላይ እንደተገለፀው።የምላሽ ምርቱ ትንተና በሬዲዮ ምልክት የተደረገበት ፕሮቲን ከ nsp12 (106 ኪ.ዲ.) ጋር አብሮ የሚፈልስ መሆኑን አመልክቷል ፣ ይህ የሚያመለክተው ኮሮናቫይረስ nsp12 የኮቫለንት ፕሮቲን-NMP adducts እንዲፈጠር ያደርጋል ፣ በተለይም በዩሪዲን ሞኖፎስፌት (ዩኤምፒ) (ምስል 1 ሀ) እና ለ)የቁጥር ትንተና እንደሚያሳየው ከሌሎች ኑክሊዮታይዶች ጋር ሲነጻጸር የ UMP ውህደት የሲግናል ጥንካሬ ከ 2 እስከ 3 ጊዜ ጨምሯል (ምስል 1C).ይህ መረጃ ከኒራን የኮሮና ቫይረስ (16) የኒራን ጎራ ከተተነበየው የNMP የማስተላለፊያ እንቅስቃሴ ጋር የሚስማማ ነው፣ ነገር ግን የኒራን የኮሮና ቫይረስ እና የደም ወሳጅ ቫይረስ ኑክሊዮታይድ ምርጫዎች የተለያዩ መሆናቸውን ያመለክታል።
የHCoV-229E nsp12 እራስ-NMPylation እንቅስቃሴ።(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) በተሰየመው [α-32P] NTP በ6 mM MnCl2 ፊት ለ 30 ደቂቃዎች (ለዝርዝር ቁሳቁሶች እና ዘዴዎች ይመልከቱ)።የምላሽ ምርቶቹ በSDS-PAGE ተለያይተው በCoomassie በሚያምር ሰማያዊ ተበክለዋል።(ለ) ራዲዮ ምልክት የተደረገበት ፕሮቲን በፎስፈረስ ምስል ይታያል።የ nsp12-His6 እና የፕሮቲን ሞለኪውላዊ ጅምላ ጠቋሚዎች (በኪሎዳልተን) በ A እና B. (C) የሬዲዮአክቲቭ ምልክት (አማካይ ± SEM) ጥንካሬ የሚወሰነው ከሶስት ገለልተኛ ሙከራዎች ነው.* ፒ≤0.05.የምልክት ጥንካሬ (መቶኛ) ከ UTP ጋር የተያያዘ ነው.
ምንም እንኳን ከኒራን ጋር የተገናኙ የኢንዛይም እንቅስቃሴዎች EAV እና SARS-CoV በሴል ባህል (16) ውስጥ ለመድገም አስፈላጊ ሆነው ቢታዩም የተወሰነው የኒራን ተግባር እና ሊሆኑ የሚችሉ ኢላማዎች ገና አልተወሰኑም።በቅርብ ጊዜ የተዘገበው በኒራን እና በፕሮቲኖች ቤተሰብ መካከል ያለው መዋቅራዊ ተመሳሳይነት በፕሮቲን ኪናሴ መሰል እጥፋት (17፣ 22) መካከል ኒራን የሌሎች ፕሮቲኖችን ኤንኤምፒላይዜሽን እንደሚያስገኝ መላምት እንድንሞክር አነሳሳን።በHCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10) የተመሰጠሩ መዋቅራዊ ያልሆኑ ፕሮቲኖችን ጨምሮ እያንዳንዳቸው የC-terminal His6 መለያ (SI አባሪ፣ ሠንጠረዥ S1) እና የ nsp12 መኖር እና አለመኖር እነዚህን ፕሮቲኖች በ [α32-P] uridine triphosphate ([α32-P] UTP) ማፍለቅ።በ E.coli ውስጥ የሚመረተው የቦቪን ሴረም አልቡሚን እና MBP-LacZα ውህደት ፕሮቲን እንደ መቆጣጠሪያ ሆኖ አገልግሏል (ምስል 2A፣ መስመሮች 1 እስከ 7)።የራዲዮ ምልክት የተደረገበት ፕሮቲን በሶዲየም ዶዴሲል ሰልፌት-ፖሊአክሪላሚድ ጄል ኤሌክትሮፎረስስ (ኤስዲኤስ-ገጽ) እና አውቶራዲዮግራፊ የተተነተነ ሲሆን በ nsp12 እና nsp9 በያዘው ምላሽ ውስጥ ኃይለኛ የራዲዮአክቲቭ ምልክት እንዳለ ተረጋግጧል።የምልክቱ አቀማመጥ ከ nsp9 ሞለኪውላዊ ክብደት ጋር ይዛመዳል፣ ይህም በ nsp12-mediated UMPylation of nsp9 (ምስል 2B፣ ትራክ 7) ያሳያል።ምንም ሌላ የሙከራ ፕሮቲኖች UMPylated ሆነው አልተገኙም፣ ይህም nsp9 የ nsp12 የተለየ አካል ነው ብለን እንድንደመድም አድርጎናል።በስእል 1 ከሚታየው የራስ-NMPylation መረጃ ጋር በመስማማት nsp12 ሁሉንም አራቱን NMPs ወደ nsp9 ማስተላለፍ ይችላል ፣ ምንም እንኳን ቅልጥፍናው የተለየ ቢሆንም ፣ UMP> adenosine monophosphate (AMP)> guanosine monophosphate (GMP)> ሳይቲዲን ሞኖፎስፌት (ሲኤምፒ)) ምስል)።3 ሀ እና ለ)በዚህ ሙከራ ውስጥ ጥቅም ላይ በሚውሉት ሁኔታዎች (ምላሹን እና የተጋላጭነት ጊዜን ያሳጥሩ ፣ የ nsp12 ትኩረትን ይቀንሱ ፣ ቁሳቁሶች እና ዘዴዎች) ፣ የ nsp12 ራስን-NMPylation ሊታወቅ አልቻለም (ምስል 2B ፣ ሌይን 7 እና ምስል 1B ያወዳድሩ)። ውጤታማ (እና በርካታ ዙሮች) UMP ከ nsp12 ወደ nsp9 ተንቀሳቅሷል።የ UMP transferase እንቅስቃሴ በስእል 3C እንደሚታየው Mn2+ ions መኖርን የሚጠይቅ ሲሆን በ Mg2+ ፊት አነስተኛ የ UMP transferase እንቅስቃሴ ብቻ የታየ ሲሆን በሌሎቹ ሁለቱ ዳይቫለንት cations ፊት ምንም አይነት እንቅስቃሴ አልተሞከረም።ሳይቲዲን ትሪፎስፌት (ሲቲፒ)፣ ጓኖሲን ትሪፎስፌት (ጂቲፒ) እና አዴኖሲን ትሪፎስፌት (ATP) (SI አባሪ፣ ምስል S1) በያዙ NMPylation ሙከራዎች ውስጥ ተመሳሳይ መረጃ ተገኝቷል።
HCoV-229E nsp12-መካከለኛ UMPylation የ nsp9.የHCoV-229E nsp12-His6⁺-መካከለኛው የ UMPylation እንቅስቃሴን ለመገምገም ተከታታይ የፕሮቲን ንጥረ ነገሮች (የቦቪን ሴረም አልቡሚንን፣ MBP-lacZα፣ እና ተከታታይ HCoV-229E nsps በ C-terminal His6 በ ORF1a የተለጠፈ) ጥቅም ላይ ውለዋል። ፕሮቲን.በእቃዎቹ እና ዘዴዎች ውስጥ በተገለፀው መሰረት ፕሮቲኑን በ [α-32P] UTP ለ 10 ደቂቃዎች በሌለበት (A) ወይም በ nsp12 መገኘት (B) ውስጥ ያሳድጉ።በ A እና B አናት ላይ SDS-polyacrylamide gel በ Coomassie Brilliant Blue የተበከለው እና በ A እና B ግርጌ, ተዛማጅ አውቶራዲዮግራሞች ይታያሉ.የፕሮቲን ሞለኪውላዊ የጅምላ ምልክት (በኪሎዳልተን) አቀማመጥ በግራ በኩል ተሰጥቷል.የ nsp12-His6 (B, top) አቀማመጥ እና የ nsp12-His6 ከ nsp9-His6 (B, lane 7) ጋር በሚፈጠርበት ጊዜ የሚታየው የሬዲዮአክቲቭ ምልክትም ተጠቁሟል ይህም [α-32P] UMP ወደ nsp9-His6 ያመለክታል. (12.9 ኪዳ)፣ ለተፈተኑ ሌሎች ፕሮቲኖች ያልታየ።
HCoV-229E ኒራን-መካከለኛ ባዮኬሚካል እና የ nsp9 NMPylation ቫይሮሎጂካል ባህሪ.(A እና B) በምላሹ ውስጥ ጥቅም ላይ የዋለው የኑክሊዮታይድ ንኡስ ክፍል ሚና።Nsp12-His6 እና nsp9-His6 የተቀላቀሉ እና የተለያዩ [α-32P] ኤንቲፒዎች በተገኙበት በመደበኛ የ NMPylation አተያይ ውስጥ የተካተቱ ናቸው።(ሀ፣ ላይ) Coomassie-የቆሸሸ nsp9-His6 በSDS-ገጽ ተለያይቷል።(ኤ ፣ ታች) የጄል ተመሳሳይ ቦታ አውቶራዲዮግራፍ።(B) በተሰየመው ኑክሊዮታይድ ኮፋክተር ፊት አንጻራዊ እንቅስቃሴ (አማካይ ± SEM) የሚወሰነው ከሶስት ገለልተኛ ሙከራዎች ነው.* ፒ≤0.05.(ሐ) የብረት ions ሚና.የሚታየው በ [α-32P] ዩቲፒ እና የተለያዩ የብረት ionዎች ሲኖሩ እያንዳንዱ የ 1 mM ክምችት ያለው መደበኛ የ NMPylation ሙከራ ነው።በ C, ከላይ, Coomassie የተቀባ nsp9-His6 ይታያል, እና በ C, ከታች, ተመጣጣኝ አውቶራዲዮግራፊ ይታያል.የተሰየመው የፕሮቲን መጠን (በኪሎዳልተን) በኤ እና ሲ በስተግራ ይታያል። በእቃዎች እና ዘዴዎች.በ NMPylation ምላሽ ውስጥ የተሰራው በሬዲዮ ምልክት የተደረገበት nsp9-His6 በፎስፈረስ ኢሜጂንግ (D, top) ተገኝቷል።ከዱር-አይነት (wt) ፕሮቲን ጋር ሲነፃፀር ያለው አንጻራዊ እንቅስቃሴ በዲ ውስጥ ይታያል, እና የታችኛው ክፍል በአማካይ (± SEM) ከሶስት ገለልተኛ ሙከራዎች ይወሰዳል.ኮከቦች ያልተጠበቁ ቅሪቶች መተካትን ያመለክታሉ።(ኢ) በባህላዊው የፒ 1 ሴሎች ውስጥ ያለው የቫይረስ ቲተር ኢንፌክሽን ከ 24 ሰዓታት በኋላ የተገኘው በፕላክ ምርመራ ተወስኗል።የኢንጂነሪንግ HCoV-229E ሚውታንት በኒራን ጎራ ውስጥ ያሉት የኮዶን መተኪያዎች ተጠቁመዋል (የተቀረው ቁጥር በpp1ab ላይ ባለው ቦታ ላይ የተመሰረተ ነው)።የማባዛት-ጉድለት የ RdRp ገባሪ ጣቢያ nsp12_DD4823/4AA እንደ መቆጣጠሪያ ጥቅም ላይ ውሏል።
የኒራንን ገባሪ ቦታ ጠለቅ ያለ ግንዛቤ ለማግኘት እና ከ nsp9-ተኮር NMP transferase እንቅስቃሴ ጋር የተያያዙ ቅሪቶችን ለመወሰን ሚውቴሽን ትንተና አደረግን ይህም በኒራን AN፣ BN እና CN ጭብጦች ውስጥ ወግ አጥባቂ ቅሪቶችን እንተካለን። 16) እሱ አላ (SI አባሪ ፣ ምስል S2) ነው።በተጨማሪም, ወግ አጥባቂ አርግ-ወደ-ላይስ ወይም ሊስ-ወደ-አርግ መተኪያዎች ተጽእኖ በሁለት ጉዳዮች ላይ ተገምግሟል.እንደ (አሉታዊ) ቁጥጥር፣ በኒራን የኮሮና ቫይረስ እና ሌሎች የጎጆ ቫይረሶች ያልተጠበቁ ወይም ያነሱ ቅሪቶች በአላ ተተክተዋል። BN) እና D4280A (CN) በ nsp12 በኩል nsp9 NMPylationን በከፍተኛ ሁኔታ ይቀንሳል ወይም ያስወግዳል, ወግ አጥባቂ ምትክ ያላቸው ፕሮቲኖች (R4178K) , K4116R) 60% እና 80% ተግባራቸውን ይይዛሉ, ይህም በየራሳቸው ጎኖቻቸው ላይ የሚደረጉ እገዳዎች መዝናናትን ያመለክታል. ሰንሰለቶች ፊዚኮኬሚካላዊ ስሜታዊ ናቸው (ምስል 3D)።ሌሎች በርካታ የተጠበቁ ቀሪዎች E4145A፣ D4273A፣ F4281A እና D4283A መተካት በጣም ያነሰ ጎጂ ነው፣ እና nsp9 UMPylation የሚቀነሰው በመጠኑ ብቻ ነው።ተመሳሳይ ውጤቶች በ nsp9 NMPylation ምላሾች ከሌሎች ኤንቲፒዎች (ምስል 3D እና SI አባሪ, ምስል S3) ጋር ተገኝተዋል, ይህም በተወሰኑ የአሚኖ አሲድ ምትክ ላይ የሚታዩት ተፅዕኖዎች ጥቅም ላይ ከሚውለው የኑክሊዮታይድ ኮምፓክት አይነት ነፃ መሆናቸውን ያረጋግጣል.በመቀጠል፣ በሴል ባህል ውስጥ የኮሮና ቫይረስ መባዛት ላይ እነዚህ የnsp12 ተተኪዎች ሊኖራቸው የሚችለውን ተጽእኖ ሞከርን።ለዚህም፣ ከ5-7 ህዋሶችን ለመገልበጥ በሪኮምቢንንት ቫኪንያ ቫይረስ (23፣ 24) የተከለሉ ተገቢ የጄኔቲክ ምህንድስና ማሟያ ዲ ኤን ኤ (ሲዲኤንኤ) አብነቶችን ተጠቀምን።በእነዚህ ህዋሶች ውስጥ የሚመረቱ ተላላፊ የቫይረስ ዘሮች መብዛት እንደሚያሳየው አብዛኛው HCoV-229E ኒራን ሚውቴሽን ተግባራዊ ሊሆን አይችልም (ምስል 3E)።አዋጭ ያልሆኑ የቫይረስ ሚውታንቶች ቡድን የNMP ማስተላለፍ እንቅስቃሴን በብልቃጥ (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A) ለማስወገድ ወይም በከፍተኛ ሁኔታ ለመቀነስ የታዩ አማራጮችን ያካትታል ነገር ግን ሌሎች ሁለት አማራጮች አሉ (K4116R, E48045A) . % የተያዘ?የእነሱ in vitro NMPylation እንቅስቃሴ ተጨማሪ ገደቦችን እንደሚያካትት ይጠቁማል።በተመሳሳይ የኒራን ኢን ቪትሮ ኤንኤምፒላይዜሽን እንቅስቃሴ መጠነኛ መቀነስ ያስከተለ ሁለት ሌሎች ሚውቴሽን (R4178K፣ F4281A) የቀጥታ ቫይረሶችን ያመነጫሉ ነገር ግን እነዚህ ቫይረሶች በማባዛት ቲተርን በእጅጉ ቀንሰዋል።በስእል 3D ላይ ከሚታየው የ in vitro እንቅስቃሴ መረጃ ጋር በመስማማት በኮሮና ቫይረስ እና/ወይም ሌሎች የተከማቸ ቫይረሶችን (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) ሌሎች አራት ቀሪዎችን በመተካት አዋጭ የሆኑ ቫይረሶችን አፍርተዋል። ከዱር-ቫይረስ ጋር ሲነፃፀር በመጠኑ የተቀነሰ ቲተር (ምስል 3E).
በኒራን መካከለኛ የ NMP ማስተላለፍ እንቅስቃሴ በንቁ RdRp ጎራ ላይ የተመረኮዘ ስለመሆኑ ለማጥናት በRdRp motif C ውስጥ የሚገኙት ሁለቱ የተጠበቁ የአስፕ ቅሪቶች (11) በ RdRp motif C ውስጥ የተካተቱት በአላ ተተክተዋል። የተገኘው ፕሮቲን nsp12_DD4823/4AA ይቆያል። በውስጡ nsp9 NMPylation እንቅስቃሴ, በ nsp12-መካከለኛ በብልቃጥ nsp9 NMPylation እንቅስቃሴ polymerase እንቅስቃሴ የማይፈልግ መሆኑን ያሳያል (SI አባሪ, ምስል S4).
የ nsp9-specific NMP transferase እንቅስቃሴን ለnsp12 ካቋቋምን በኋላ፣ NMP-nsp9 adduct በ mass spectrometry (MS) ለመለየት ሞክረናል።የድጋሚ ኮምቢንንት HCoV-229E nsp9 የተሟላ የፕሮቲን ብዛት ስፔክትረም 12,045 ዳ (ምስል 4A) ላይ ከፍተኛውን ደረጃ አሳይቷል።የ nsp12 መጨመር የ nsp9 ጥራትን አልለወጠም, ይህም nsp12 እና nsp9 ጥቅም ላይ በሚውሉ ሁኔታዎች (denaturation) ውስጥ የተረጋጋ ውስብስብ እንደማይሆኑ ያሳያል (ምስል 4A).ዩቲፒ እና ጂቲፒ ባሉበት የጅምላ ምላሽ nsp9 እና nsp12 የያዘው ምላሽ በቅደም ተከተል የዩቲፒ ፕሮቲን ብዛት 306 ዳ ተንቀሳቅሷል እና የጂቲፒ ፕሮቲን ብዛት 345 ዳ ተንቀሳቅሷል ይህም እያንዳንዱ nsp9 ሞለኪውል UMP ወይም GMP እንደሚያስር ያሳያል። (ሥዕል 4) ሐ እና መ)ለNiRAN-mediated nsp9 NMPylation የሚያስፈልገው ሃይል ከኤንቲፒ ሃይድሮሊሲስ እና ከፒሮፎስፌት ልቀት እንደሚመጣ ተገምቷል።ምንም እንኳን በዚህ ምላሽ ከ nsp12 (ኢንዛይም) 10 እጥፍ በላይ የሆነ የ nsp9 (ዒላማ) ትርፍ ጥቅም ላይ የዋለ ቢሆንም፣ ሙሉ በሙሉ ማለት ይቻላል NMPylation የ nsp9 ታይቷል፣ ይህም በ nsp12 እና nsp9 መካከል ያለው መስተጋብር ለአጭር ጊዜ የሚቆይ መሆኑን ያሳያል፣ እና nsp12 ተጨማሪ nsp9 NMPylate ይችላል በብልቃጥ ውስጥ ሞለኪውል.
ነጠላ NMPylation nsp9 በ nsp12 እና UTP ወይም GTP ፊት.የሚታየው የHCoV-229E nsp9 (SI አባሪ፣ ሠንጠረዥ S1) (AD) የተለቀቀው ሙሉ የፕሮቲን ብዛት ስፔክትረም ነው።(A) nsp9 ብቻ፣ (B) nsp9 + nsp12-His6፣ (C) nsp9 + nsp12-His6 በ UTP ፊት፣ (D) nsp9 + nsp12-His6 በጂቲፒ ፊት።
የ nsp9 ቀሪዎችን UMPylated በ nsp12 ለመወሰን nsp9-UMP በትሪፕሲን ተሰንጥቋል።የተገኙት peptides በ nano-high አፈጻጸም ፈሳሽ ክሮማቶግራፊ (HPLC) ተለያይተው በታንደም mass spectrometry (ኤምኤስ/ኤምኤስ) ኦንላይን ተንትነዋል።የባዮኒክ ሶፍትዌር ፓኬጅ (ፕሮቲን ሜትሪክስ) በመጠቀም የመረጃ ትንተና የኤን-ተርሚናል አሚኖ አሲድ UMPylation አሳይቷል።ይህ በእጅ የተረጋገጠ ነው.የቀዳሚው peptide [UMP] NNEIMPGK (SI አባሪ፣ ምስል S5A) የታንዳም ጅምላ ስፔክትረም 421 m/z ላይ አንድ ቁራጭ አሳይቷል፣ ይህም UMP ከ nsp9 1 ቅሪት ጋር እንደሚቆራኝ ያሳያል።
በ nsp9 N-terminus ላይ, አስን በ Orthocoronavirinae (SI አባሪ, ምስል S6) አባላት መካከል ተጠብቆ ይገኛል.ምንም እንኳን N-terminal primary amine ናይትሮጅን ለ UMP በጣም ተቀባይ ነው ብለን ብናምንም፣በ N-ተርሚናል ላይ የNMP አስገዳጅነት ተጨማሪ ማስረጃ ለማግኘት ወስነናል።በዚህ ምክንያት በ HPLC የተጣራ NMPylated እና NMPylated N-terminal peptide nsp9 የተገኘው አሴቶን እና ሶዲየም ሳይያኖቦሮይድራይድ ባሉበት ነው።በነዚህ ሁኔታዎች ነፃ ዋና አሚኖች ብቻ በ propyl (25) ሊቀየሩ ይችላሉ።N-terminal nsp9-የተገኘ peptide ከ NNEIMPGK ቅደም ተከተል ጋር ሁለት ዋና አሚኖችን ይይዛል፣ አንደኛው በ N-terminus of Asn እና ሌላኛው በሊዝ የጎን ሰንሰለት በ C-terminus።ስለዚህ, የ propyl ቡድኖች በሁለቱም ጫፎች ሊተዋወቁ ይችላሉ.ከኤንኤምፒላይድ ያልሆኑ peptides የሚወጣው ion ክሮሞግራም በSI አባሪ፣ ምስል S5B ላይ ይታያል።እንደተጠበቀው፣ N-terminal እና C-terminal (mono) propylated (SI appendix፣ Figure S5B፣ የላይኛው ሌይን) እና ዳይፕሮፒሌትድ ፔፕቲዶች (SI አባሪ፣ ምስል S5B፣ የታችኛው መስመር) ተለይተው ይታወቃሉ።ይህ ስርዓተ-ጥለት የሚለወጠው NMPylated N-terminal peptide of nsp9 በመጠቀም ነው።በዚህ ሁኔታ C-terminal propylated peptides ብቻ ሊታወቅ ይችላል, ነገር ግን N-terminal propylated peptides እና dipropylated peptides አይታወቅም (SI አባሪ, ምስል S5C) ይህ ለመከላከል UMP ወደ N-terminal primary amine መተላለፉን ያመለክታል. ቡድን ለውጦችን ከማድረግ.
በመቀጠል (በአላ ወይም ሰር) እንተካለን ወይም የተቀመጡትን ቀሪዎች በ nsp9 N-terminus ላይ እንሰርዛለን ኢላማ-ተኮር ገደቦችን ለመወሰን።በእኛ የኤምኤስ መረጃ መሰረት ኒራን ከ NSP9 N-terminal ተረፈ አሚን ጋር የ nsp9-NMP መግቢያን እንደፈጠረ፣ እኛ nsp9 NMPylation የቫይራል ማስተር ፕሮቲኤዝ (Mpro, nsp5) የ nsp9 N-terminal ከ nsp9 እንዲለቀቅ እንደሚፈልግ ገምተናል። የእሱ የ polyprotein ቅድመ ሁኔታ.ይህንን መላምት ለመፈተሽ በ E. coli ውስጥ nsp9 ን የያዘ ቀዳሚ ፕሮቲን nsp7-11 አዘጋጀን እና በ [α-32P] UTP (ቁሳቁሶች እና ዘዴዎች) ፊት መደበኛ የ NMPylation ሙከራ አደረግን።በስእል 5A (ሌይን 3) ላይ እንደሚታየው ያልተቆረጠ nsp7-11 ቀዳሚው በ nsp12 በሬዲዮ አልተሰየመም።በአንጻሩ፣ nsp7-11 በ recombinant nsp5 ከተሰነጣጠለ nsp9 (እና ሌሎች nsps) ከቅድመ-መቅደሱ፣ ከ nsp9 ጋር የሚፈልስ በራዲዮ ምልክት የተደረገበት ፕሮቲን ተገኝቷል፣ ይህም NiRAN እና N- Selective formation of covalent nsp9-NMP ያመጣሉ የሚለውን መደምደሚያ ያረጋግጣል። .የN-terminal Asn ተርሚናል ቀዳሚ አሚን (ቦታ 3825 በpp1a/pp1ab)።ይህ መደምደሚያ በ N-terminus ላይ አንድ ወይም ሁለት ተጨማሪ ቅሪቶችን የያዘው nsp9 ግንባታን በሚጠቀሙ ሙከራዎች የተደገፈ ነው።በሁለቱም ሁኔታዎች፣ በኒራን-መካከለኛ የተደረገ የ nsp9 UMPylation ተሰርዟል (SI አባሪ፣ ምስል S7)።በመቀጠል፣ ከ3825-NNEIMPK-3832 peptide ቅደም ተከተል በ N-terminal of nsp9 ላይ አንድ ወይም ሁለት የአስኤን ቅሪቶች የተሰረዙ ፕሮቲን አምርተናል።በሁለቱም ሁኔታዎች, nsp9 UMPylation ሙሉ በሙሉ ታግዷል (ምስል 5B), እውነተኛው nsp9 N-terminus እንደ NMP ተቀባይ እንደሚሰራ ተጨማሪ ማስረጃዎችን ያቀርባል.
የ nsp9 ፕሮቲዮቲክ ሂደት እና የ N-terminal ተረፈዎች ሚና በ nsp12-መካከለኛው UMPylation ውስጥ።(A) nsp9 UMPylation ነጻ nsp9 N-ተርሚናል ያስፈልገዋል።Nsp7-11-His6 በ 30 ዲግሪ ሴንቲግሬድ ውስጥ በ NMPylation ማወቂያ ቋት ውስጥ ዩቲፒን በያዘው ሪኮምቢንነንት Mpro (nsp5-His6) መኖር እና አለመኖር ቀድሞ ተዘጋጅቷል።ከ 3 ሰዓታት በኋላ NMPylation assay ን በቁሳቁሶች እና ዘዴዎች ውስጥ በተገለፀው መሰረት nsp12-His6 ን ጀምር።nsp5-His6 (ሌይን 1) እና nsp9-His6 (ሌይን 2) የያዘው ምላሽ እንደ መቆጣጠሪያ ጥቅም ላይ ውሏል።ከ 10 ደቂቃዎች በኋላ, ምላሹ ተቋረጠ እና የምላሽ ድብልቅ በ SDS-PAGE ተለያይቷል.ፕሮቲኑ በCoomassie Brilliant Blue (A, top) ተበክሏል.የ Nsp7-11-His6 ቅድመ ሁኔታ እና በ nsp5-His6 የሽምግልና መሰንጠቅ ምክንያት የተሰራው ምርት በቀኝ በኩል ይታያል።እባክዎን ያስተውሉ (በአነስተኛ መጠናቸው) nsp7 እና nsp11-His6 በዚህ ጄል ውስጥ አይገኙም እና ምላሹ በ nsp5-His6 ተጨምሯል (ሌይን 1 እና 4 ፣ የ nsp5-His6 አቀማመጥ በጠንካራ ክበብ ይገለጻል) ወይም nsp9-His6 (ሌይን 2) እንደ MBP ውህድ ፕሮቲኖች (SI appendix፣ Table S1) ስለሚገለጹ እንደ ቀሪ ቆሻሻዎች አነስተኛ መጠን ያለው MBP (በክፍት ክበቦች የተገለጸ) ይዟል።(ለ) የ Nsp9-His6 ተለዋጭ አንድ ወይም ሁለት የN-terminal Asn ቅሪቶች (ቅሪ ቁጥር በ pp1a/pp1ab ላይ ባለው አቀማመጥ መሠረት) እና በ nsp12-His6 እና [α-32P] UTP ተጣርቶ ይጨመራል።B፣ SDS-PAGE በ Coomassie የተበከለው ከላይ፣ B፣ ተጓዳኝ አውቶራዲዮግራፍ ከታች ይታያል።የሞለኪውል ክብደት ጠቋሚው አቀማመጥ (በኪሎዳልተን) በግራ በኩል ይታያል.(ሐ) HCoV-229E nsp9-His6 N-terminal የተጠበቁ ቅሪቶች በአላ ወይም በሰር ተተክተዋል፣ እና ተመሳሳይ መጠን ያለው ፕሮቲን በ nsp12-His6 መካከለኛ UMPylation ምላሽ ላይ ጥቅም ላይ ውሏል።የምላሽ ምርቶቹ በSDS-PAGE ተለያይተው በCoomassie Brilliant Blue (C፣ top) ተበክለዋል፣ እና በራዲዮ ምልክት የተደረገባቸው nsp9-His6 በphosphorescence imaging (ሲ፣ መካከለኛ) ተገኝቷል።የዱር-አይነት (wt) ፕሮቲን እንደ ማጣቀሻ (ወደ 100% ተቀናብሯል) በመጠቀም አንጻራዊ የ NMPylation እንቅስቃሴ (አማካይ ± SEM) ከሶስት ገለልተኛ ሙከራዎች ይሰላል።(D) የቫይረስ ቲተሮች በፒ1 ሴል ባሕል ውስጥ የሚገኙት Huh-7 ሕዋሳት በHCoV-229E የዱር-አይነት ሁህ-7 ህዋሶች የተበከሉ እና በ nsp9 ውስጥ የተሰየሙ የአሚኖ አሲድ ተተኪዎችን የያዙ ሙታንቶች የሚወሰኑት በፕላክ ምርመራ ነው።የማባዛት ጉድለት ያለበት RdRp motif C double mutant DD4823/4AA እንደ አሉታዊ ቁጥጥር ጥቅም ላይ ውሏል።
የ N-terminus የ nsp9 (በተለይ 1 ፣ 2 ፣ 3 እና 6) በ Orthocoronavirinae ንኡስ ቤተሰብ አባላት መካከል በጣም የተጠበቀ ነው (SI አባሪ ፣ ምስል S6)።በ nsp12-mediated nsp9 NMPylation ውስጥ የእነዚህን ቅሪቶች ሚና ለማጥናት በ NSP9 N-terminus ላይ ሁለት ተከታታይ የአስኖ ቅሪቶች በአላ ወይም በሴር (ብቻ ወይም ጥምር) ተተክተዋል።ከዱር-አይነት nsp9 ጋር ሲነጻጸር N3825ን በአላ ወይም Ser በመተካት በ nsp12-mediated UMPylation (ምስል 5C) ከሁለት እጥፍ በላይ እንዲቀንስ አድርጓል።NMPylation በ N-terminal primary amine ላይ ከ N-terminal ተረፈ የጎን ሰንሰለት ይልቅ ከ NMPylation ከደረሰን መደምደሚያ ጋር በሚስማማ መልኩ N3825A እና N3825S በመተካት ጉልህ የሆነ ቀሪ NMPylation ተመልክተናል።የሚገርመው ነገር, ሁለተኛው አስን በአላ ወይም በሴር ከተተካ, nsp9 UMPylation በጠንካራ ሁኔታ (ከ 10 ጊዜ በላይ) ይቀንሳል, በ 3, 4, እና 6 ላይ የአላ መተካት በ nsp9 UMPylation ላይ መጠነኛ ተጽእኖ ብቻ ነው (ምስል 2). ) .5C)።ATP፣ CTP ወይም GTP (SI አባሪ፣ ምስል S8) በመጠቀም ተመሳሳይ ውጤቶች ተገኝተዋል።በአጠቃላይ እነዚህ መረጃዎች N2826 (በ nsp9 ውስጥ 2 አቀማመጥ) በ nsp9 NMPylation ውስጥ ያለውን ቁልፍ ሚና ያመለክታሉ።
በ N-terminus የ nsp9 እና NMPylation መካከል ያለውን የተግባር ትስስር ተጨማሪ ማስረጃ ለማግኘት የኮሮናቫይረስ ቤተሰብን (በ104 እና 113 ቅሪቶች መካከል የሚለያዩ) በርካታ ተከታታይ አሰላለፍ (MSA) አከናውነናል። ኤስ 6)በጠቅላላው በ 47 (የታወቁ እና የተቀመጡ) የ 5 ዝርያዎች Orthocoronavirinae ንዑስ ቤተሰብ ውስጥ የተለያዩ አጥቢ እንስሳትን ፣ ወፎችን እና ተሳቢ እንስሳትን የሚጎዱ ፣ በአጠቃላይ 8 ቅሪቶች ብቻ የማይለዋወጡ ናቸው ።በቀደሙት መዋቅራዊ ጥናቶች (26 ??28) እንደተወሰነው በ nsp9 ሁለተኛ ደረጃ መዋቅር አካላት መካከል ባሉት ዑደቶች ውስጥ ስረዛዎችን እና ማስገባትን ጨምሮ በጣም ሰፊ ለውጦች ታይተዋል።በ nsp9 የ C-terminal ክፍል β strand እና α ሄሊክስ ውስጥ አምስት የማይለዋወጡ ቅሪቶች ተገኝተዋል።ሶስት የማይለዋወጡ ቅሪቶች የ NNE motif የ N ተርሚነስ የnsp9 ናቸው።የዚህ ጭብጨባ ሁለተኛ Asn ብቻ የማይለዋወጥ ቀሪዎች እንደሆነ ተገልጿል, ይህም ደግሞ ሩቅ ተዛማጅ እንቁራሪት ኮሮናቫይረስ ያለውን መላምታዊ nsp9 የሚጋራ, እና Alphaletovirus መካከል Letovirinae ንዑስ ቤተሰብ ውስጥ Microhyla letovirus 1 ዝርያዎች ይወክላል.በ nsp9 ሁለተኛ ደረጃ መዋቅር ክፍሎች ውስጥ ያሉ ቅሪቶች መቆጠብ መታጠፍን ወይም የታወቁ የአር ኤን ኤ ማሰሪያ ባህሪያትን ለመጠበቅ በመዋቅራዊ ግምት ሊታሰብ ይችላል።ነገር ግን, ይህ ምክንያት ለኤንኤንኤን ጥበቃ የሚውል አይመስልም, እና ከዚህ ጥናት በፊት, የ trieptide ቅደም ተከተል ልዩነትን የሚገድቡ ገደቦች ተፈጥሮ ሙሉ በሙሉ ተደብቋል.
የ nsp9-NMPylation እና NNE ጥበቃን በኮሮና ቫይረስ መባዛት ላይ ያለውን ጠቀሜታ ለማወቅ HCoV-229E ሚውቴሽን አምርተናል፣ እነዚህም ነጠላ ወይም ሁለት የ nsp9 N-terminal ተረፈዎችን የሚይዙ ሲሆን ይህም nsp9 NMPylation በብልቃጥ ውስጥ ጎጂ መሆኑን ያሳያል።ከመጀመራችን በፊት፣ እነዚህ ተተኪዎች (በ nsp8|9 የመክፈያ ቦታ አጠገብ) በC-terminal pp1a ክልል ፕሮቲዮቲክ ሂደት ላይ ተጽዕኖ ስለመሆኑ ጥያቄውን ለመመለስ እንሞክራለን።በ N-terminus of nsp9 ላይ ተጓዳኝ ተተኪዎችን የያዙ የ nsp7-11 የ polyprotein ግንባታዎች ስብስብ በኢ.በእነዚህ ፕሮቲኖች ውስጥ በMpro-mediated nsp8|9 cleavage (ወይም ሌላ) ላይ ጣልቃ የሚገቡ ፕሮቲኖች መዋቅራዊ ለውጦችን ሳያካትት የአራቱ ቦታዎች የፕሮቲዮቲክ ስንጥቅ (የ nsp9 flanking ጣቢያን ጨምሮ) በማንኛውም አስተዋወቀ ምትክ ላይ ተጽዕኖ አያሳድርም (ወይም ሌላ) ድህረገፅ.
Huh-7 ሕዋሳት በጂኖም ርዝመት HCoV-229E አር ኤን ኤ ተለውጠዋል፣ በNSP9 N ተርሚነስ ላይ በአላ ወይም በሴር ምትክ በተቀመጡት NNE tripeptides (N3825፣ N3826፣ እና E3827) ውስጥ በኮድ በማስቀመጥ፣ ይህም አብዛኛው ሚውቴሽን ገዳይ መሆኑን ያሳያል።ቫይረሱን ማዳን የቻልነው Ser ወይም Ala of the N-terminal Asn (N2835A ወይም N2835S) በመተካት ቫይረሱን ማዳን ችለናል፣ ነገር ግን ቫይረሱን ከሌሎች ነጠላ እና ሁለት ሚውቴሽን በኤንኤን ተከታታይ (N3826A፣ N3826S፣ NN3825/6AA) ማገገም አልቻልንም። NN3825/6SS)፣ E3827A) (ምስል 5D)።
እነዚህ ውጤቶች እንደሚያመለክቱት የኮሮና ቫይረስ በቲሹ ባህል ውስጥ መባዛት የተከለከለ ነው (ተመሳሳይ ወይም ተመሳሳይ)፣ በሰውነት ውስጥ የ nsp9 NMPylation ሳይቶች ተፈጥሯዊ ሚውቴሽን በመገደብ እና የዚህ ምላሽ ቁልፍ ሚና በኮሮና ቫይረስ የሕይወት ዑደት ውስጥ መደገፍ ነው።
በመጨረሻው የሙከራ ስብስብ ውስጥ፣ C-terminal His6 የሚል ስያሜ ያለው SARS-CoV-2 nsp12 እና nsp9፣ እና በE.coli ውስጥ ሁለት የሚውቴሽን የ nsp12 ቅርጾችን አምርተናል።በNiRAN እና RdRp ጎራዎች ውስጥ ያሉት ንቁ የጣቢያ ቅሪቶች በቅደም ተከተል በምትኩ Ala ይጠቀሙ ነበር (ምስል 6A እና SI አባሪ፣ ሠንጠረዥ S2)።በ SARS-CoV-2 nsp12 ውስጥ K4465 ከ K4135 ጋር ይዛመዳል HCoV-229E (SI አባሪ፣ ምስል S2)፣ ይህም ለኒራን እንቅስቃሴ እና ለ HCoV-229E ማባዛት እንደሚያስፈልግ ተረጋግጧል (ምስል 3D እና E)።ይህ ቅሪት ከዚህ ቀደም ለኒራን ራስን-UMPylation/self-GMPylation (16) አስፈላጊ ሆኖ ከታየው የደም ወሳጅ ቫይረስ EAV nsp9 K94 ቀሪዎች ጋር ይዛመዳል።በስእል 6B ላይ እንደሚታየው SARS-CoV-2 nsp12 nsp9ን እንደ substrate በመጠቀም UMP transferase ተግባር ያለው ሲሆን የ nsp12_K4465A ገባሪ ሳይት ሚውታንት እንቅስቃሴ አልባ ነው።በ RdRp motif C የ SDD ባህሪ ቅደም ተከተል ውስጥ ያለው ድርብ መተካት የ UMP transferase እንቅስቃሴን አይጎዳውም (ምስል 6B) ይህም የ RdRp እንቅስቃሴ በ nsp9 UMPylation ውስጥ ቀጥተኛ ተጽእኖ እንደሌለው ያሳያል።ተመሳሳይ መረጃ CTP፣ GTP እና ATP (SI አባሪ፣ ምስል S10) በመጠቀም ተገኝቷል።በማጠቃለያው እነዚህ መረጃዎች እንደሚያመለክቱት በNiRAN-mediated nsp9 NMPylation ውስጥ የተለያዩ የኦርቶኮሮና ቫይረስ ንዑስ ቤተሰብን የሚወክል ወግ አጥባቂ እንቅስቃሴ እንዳለው ያሳያል።
SARS-CoV-2 nsp12-mediated NMPylation of nsp9.(A) Coomassie የኤስዲኤስ-ፖሊአክሪላሚድ ጄል በNMPylation ሙከራ ውስጥ ጥቅም ላይ የዋለውን ድጋሚ ፕሮቲን ያሳያል።እንደ መቆጣጠሪያ፣ በNiRAN ጎራ (K4465A) እና RdRp ጎራ (DD5152/3AA) SARS-CoV-2 nsp12 ውስጥ ንቁ የጣቢያ ምትክ ያለው የሚውቴሽን ፕሮቲን ጥቅም ላይ ውሏል።የተቀረው ቁጥር በpp1ab ላይ ባለው አቀማመጥ ላይ የተመሰረተ ነው።(ለ) nsp9-His6 እና [α-32P] UTP እንደ nsp12-His6 (የዱር ዓይነት [wt] እና ሚውታንት) በመጠቀም የ UMPylation ማወቂያ አውቶራዲዮግራፍ።የተለጠፈው ፕሮቲን ሞለኪውላዊ ክብደት (በኪሎዳልተን) በግራ በኩል ይታያል።
የኒራን ጎራዎች በአጠቃላይ በኒዶቪራሌስ (16) ውስጥ ተጠብቀዋል፣ ይህም ለኒዶቫይረስ መባዛት አስፈላጊ የሆኑ ኢንዛይም ምላሾችን እንደሚያበረታቱ ያሳያል።በዚህ ጥናት ውስጥ፣ የኮሮና ቫይረስ የኒራን ጎራ NMP (ከኤንቲፒ የመነጨ) ወደ nsp9፣ በቫይረስ ማባዛት ውስጥ የተሳተፈውን ሚስጥራዊ የአር ኤን ኤ ማሰሪያ ፕሮቲን (26 ?? 29) እንደሚያስተላልፍ ለማረጋገጥ ችለናል፣ እንደ ተፈጥሯዊ ኢላማ እና ለመወሰን ችለናል። የኮሮናቫይረስ RTC አጋር።
የኒራን ጎራ ሶስት ተከታታይ ጭብጦችን (AN፣ BN እና CN) ያካፍላል፣ እነዚህም በሁሉም ቤተሰቦች ውስጥ በሞኖፊልቲክ ግን በጣም ልዩ በሆነው የኒዶቪራሌስ ቅደም ተከተል (8፣ 16) የተጠበቁ በጣም አነስተኛ ቁጥር ያላቸው ቅሪቶች አሉት።በቅርብ ጊዜ የተደረጉ ጥናቶች እንደሚያሳዩት በመሠረቱ የሴሎ ቤተሰብ (17, 19, 22, 30, 31) ተብለው ከሚጠሩት የፕሮቲን ኪናሴስ መሰል ፕሮቲኖች በአብዛኛው ከማይታወቅ ቤተሰብ ጋር የተያያዙ ናቸው.ከሴሎ ጋር የተገናኙ ፕሮቲኖች የ kinase folds አላቸው፣ ነገር ግን በክላሲካል ኪናሴስ (22፣ 32) ውስጥ ብዙ የተጠበቁ ንቁ የጣቢያ ቅሪቶች የላቸውም።በATP ሞለኪውሎች ከገባሪው ቦታ ጋር በተያያዙት እና በተወሰኑ መስተጋብሮች የተረጋጋ የATP ሞለኪውሎች ተገላቢጦሽ አቅጣጫ ላይ በመመስረት፣ SelO መላምት ተደርጎበታል እና በመቀጠል AMP (ከፎስፌት ይልቅ) ወደ ፕሮቲን ንጥረ ነገር (22) ለማስተላለፍ የተረጋገጠ ሲሆን ሌላ የባክቴሪያ ሴሎ-መሰል ፕሮቲን YdiU አለው። በቅርቡ የ UMPን ከቲር እና የእሱ ቅሪቶች የተለያዩ የፕሮቲን ንዑሳን ክፍሎች (33) ትስስርን እንደሚያበረታታ ታይቷል።
የኮሮና ቫይረስ ኒራን ጎራ ያለውን የፑቲቭ አክቲቭ ሳይት ቀሪዎችን ትንበያ ለማረጋገጥ እና ለማስፋት፣ በኮሮና ቫይረስ nsp12 ላይ ሚውቴሽን ትንታኔን ለማድረግ ባዮኬሚካል እና የተገላቢጦሽ የዘረመል ዘዴዎችን ተጠቀምን (ምስል 3D እና E እና SI አባሪ፣ ምስል S3 እና ሠንጠረዥ) S1â ኤስ 4)መረጃው እንደሚያሳየው የ HCoV-229E K4135, R4178 እና D4280 በአላ መተካት የኤን.ኤም.ፒ. ማስተላለፍ እንቅስቃሴን እና የቫይረስ ማባዛትን ያስወግዳል በሴል ባህል (ምስል 3D እና E እና SI ተጨማሪዎች, ምስል S3) በ NTP γ-ፎስፌት ውስጥ መገኘታቸውን ይደግፋል. (K4135, R4178) እና ንቁ የጣቢያው የብረት ions (D4280) ቅንጅት.የ K4135 (17) ቦታን ለማረጋጋት በተተነበየው የ E4145A ተጠብቆ የሚገኘውን ግሉን መተካት የቫይረስ ማባዛትን ለማስወገድ ታይቷል ፣ ግን በሚያስደንቅ ሁኔታ ፣ እንቅስቃሴው በብልቃጥ ውስጥ ተይዟል NMPylation ሙከራ (ምስል 3D እና E እና SI አባሪ፣ ምስል S3 እና ሰንጠረዦች S1-S4)።ተመሳሳዩ ምልከታ በYdiU homolog of Salmonella typhimurium (E130A) (33) ውስጥ ሲገባ ተመሳሳይ ምልከታ ተደርጓል።አንድ ላይ ሲደመር፣ እነዚህ መረጃዎች ከካታሊቲክ ተግባር ይልቅ የዚህን የተከማቸ ቅሪት የቁጥጥር ተግባር ይደግፋሉ።
በ HCoV-229E NiRAN ጎራ (8) ውስጥ የተጠበቀውን የ Phe ቅሪት (F4281A) በኔስቶቫይረስ ክልል ውስጥ መተካት የ NMPylation እንቅስቃሴ በብልቃጥ ውስጥ እንዲቀንስ እና በሴል ባህል ውስጥ የቫይረስ መባዛት በከፍተኛ ሁኔታ ቀንሷል (ምስል 3D ፣ E እና SI) አባሪ, ምስል S3).ውሂቡ ከዚህ ቅሪት አስፈላጊ የቁጥጥር ተግባር ጋር የሚስማማ ነው፣ ከዚህ ቀደም ከሚታየው ተመሳሳይ የ DFG motif Phe ቀሪዎች።በክላሲካል ፕሮቲን ኪንሴስ ውስጥ፣ የMg2+ አስገዳጅ loop አካል ነው እና አከርካሪውን ለመሰብሰብ እና ለማስተካከል ይረዳል???ውጤታማ የካታሊቲክ እንቅስቃሴ (32, 34) ያስፈልጋል.አላ እና አርግን በ K4116 ቅሪቶች መተካት (በቅድመ-አን ሞቲፍ) ፣ በቅደም ተከተል ፣ የቫይረስ ማባዛትን ያስወግዳል እና እንደተጠበቀው ፣ በቪትሮ ውስጥ በ NMP transferase እንቅስቃሴ ላይ የተለያዩ ተፅእኖዎች ነበሩት ፣ እንደ አሚኖ አሲድ የጎን ሰንሰለት ላይ በመመስረት (ምስል 3D እና E እና SI ተጨማሪዎች) , ምስል S3).የተግባር መረጃው ከመዋቅራዊ መረጃው ጋር የሚጣጣም ነው, ይህ ቅሪት ከ ATP ፎስፌት (17) ጋር መስተጋብር መፈጠሩን ያመለክታል.በሌሎች የጎጆ ቫይረስ ቤተሰቦች የኒራን ጎራ ውስጥ፣ የHCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 አቀማመጥ በ Lys፣ Arg or His (8) ተይዟል፣ ይህም የዚህ ልዩ ቅሪት ተግባራዊ ገደብ ዘና ያለ መሆኑን ያሳያል።የD4188A እና D4283A መተካት የኢንዛይም እንቅስቃሴን ያስወግዳል ወይም በእጅጉ ይቀንሳል እና የቫይረስ መባዛትን ያስወግዳል (ምስል 3)።እነዚህ ሁለት ቅሪቶች በአብዛኛዎቹ (ነገር ግን ሁሉም አይደሉም) በተከማቸባቸው ቫይረሶች (8) ውስጥ ተጠብቀው ይገኛሉ፣ ይህም አስፈላጊ ቤተሰብን የተመለከተ ግን ምናልባት ካታሊቲክ ያልሆነ ተግባር ነው።በCoronaviridae ወይም በሌሎች የኔስቲዮቪሪዳኢ ቤተሰቦች (8) ውስጥ ያልተጠበቁ የበርካታ ሌሎች የላይስ እና የአስፕ ቅሪቶች (K4113A፣ D4180A፣ D4197A እና D4273A) የአላ መተካት እንደ መቆጣጠሪያ ጥቅም ላይ ውለዋል።እንደተጠበቀው, እነዚህ ተተኪዎች በአብዛኛው የሚታገሱ ናቸው, የኢንዛይም እንቅስቃሴ በትንሹ በመቀነስ እና በአንዳንድ ሁኔታዎች የቫይረስ ማባዛት (ምስል 3 እና SI አባሪ, ምስል S3).በአጠቃላይ፣ የኮሮና ቫይረስ ሙታጄኔሲስ መረጃ ከራስ ጂኤምፒ እና ከ EAV NiRAN-RdRp (16) የዘረመል መረጃ ጋር በጣም የተጣጣመ ነው፣ በዚህ ውስጥ EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ortholog) ቀሪ K94 (ከHCoV-229E K4135 ጋር የሚዛመድ) ጠቃሚ ተግባራት)። R124 (ከ R4178 ጋር የሚዛመድ), D132 (ከ D4188 ጋር የሚዛመድ), D165 (ከ D4280 ጋር የሚዛመድ), F166 (ከ F4281 ጋር የሚዛመድ).በተጨማሪም፣ የHCoV-229E ሚውቴጀኔሲስ መረጃ ከዚህ ቀደም ከተዘገበው SARS-CoV የተገላቢጦሽ የዘረመል መረጃ (16) ጋር የሚጣጣም እና የተስፋፋ ነው፣ ልክ ለተዛማጅ የCN motif Phe-to-Ala mutant SARS-CoV_nsp12 ከተመለከቱት ጋር ተመሳሳይ ነው። phenotype ተገልጿል -F219A እና HCoV-229E_F4281A (ምስል 3 D እና E እና SI አባሪ, ምስል S3 እና ሠንጠረዥ S1-S4).
ለ UTP እና GTP (በራስ-NMPylation ምላሽ) ግልጽ ምርጫ ካላቸው EAV orthologs (16) ጋር ሲነጻጸር ጥናታችን እንደሚያሳየው የኮሮና ቫይረስ ኒራን (በHCoV-229E እና SARS-CoV-2 የተወከለው) ውጤታማ ሊሆን ይችላል። ምንም እንኳን ለ UMP ትንሽ ምርጫ ቢኖርም ሁሉንም አራቱን NMPs አስተላልፈዋል (ምስል 1 እና 3)።የ ADP-Mg2+ ከኒራን ንቁ ቦታ ጋር የሚያያዝበት፣ የ ADP-Mg2+ ከAdenine Part ጋር የሚያያዝበት፣ የ ADP-Mg2+ የተወሰነው የNTP ተባባሪ ንኡስ ክፍል በቅርቡ ከተዘገበው SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 ሱፐር ኮምፖዚት መዋቅር ጋር የሚስማማ ነው። የተወሰኑ ግንኙነቶች መፈጠር (17).በጥናታችን ውስጥ, በ NMPylation ምላሽ ውስጥ ጥቅም ላይ የሚውለው የኑክሊዮታይድ አይነት በተለዋዋጭ ፕሮቲን (SI አባሪ, ምስል S3) እንቅስቃሴ ላይ ምንም ልዩነት የለውም, ይህም ከእነዚህ ቅሪቶች መካከል አንዳቸውም ቢሆኑ ከአንድ የተወሰነ ኑክሊዮቤዝ ትስስር ጋር ምንም ግንኙነት የላቸውም.በኒራን የኮሮና ቫይረስ እና ደም ወሳጅ ቫይረሶች ውስጥ የተስተዋሉት የተለያዩ የNTP ተባባሪ ምርጫዎች መዋቅራዊ መሠረት እና እምቅ ባዮሎጂያዊ ጠቀሜታ አሁንም ሊጠና ነው።እውነት ሊሆኑ ይችላሉ ወይም በየራሳቸው ጥናት ውስንነት ምክንያት ሊሆኑ ይችላሉ።በአሁኑ ጊዜ የደም ወሳጅ ቫይረስ የኒራን ጎራ (ቀደም ሲል ከተገለጸው ራስን-NMPylation እንቅስቃሴ ጋር ሲነጻጸር) የ NMPylator እንቅስቃሴ በደም ወሳጅ ቧንቧ እና በኮሮና ቫይረስ መካከል ያለውን ተመሳሳይነት ከግምት ውስጥ በማስገባት የተለየ የአብሮነት ምርጫ እንዳለው ማስቀረት አይቻልም። የኒራን ጎራ ገደብ ላይ ነው።በቅደም ተከተል ላይ የተመሰረተ አወዳድር (16).Mg2+ን እንደ አስተባባሪ ከሚጠቀመው pseudokinase SelO ጋር ሲነፃፀር የኮሮና ቫይረስ እና የደም ወሳጅ ቫይረስ ኒራን እንቅስቃሴ በMn2+ (16) ላይ የተመሰረተ ነው (ምስል 3C እና SI አባሪ፣ ምስል S1)።የMn2+ ጥገኝነት እና ግልጽ ምርጫ ለ UTP ያልተለመደ የፕሮቲን NMPylators ባህሪ ነው፣ እና በቅርብ ጊዜ የተረጋገጠው በሳልሞኔላ ታይፊሙሪየም YdiU ፕሮቲን ውስጥ ነው፣ ይህም ጥብቅ Mn2+-ጥገኛ ፕሮቲን ቻፔሮን UMPylation ሴሎችን ከውጥረት መነሳሳት የሕዋስ ATP ገንዳ (ሴሎች) ይከላከላል። 33)።
በቅርብ ጊዜ የተገለጸው መዋቅራዊ መመሳሰል በኮሮና ቫይረስ ኒራን ጎራ እና ሴሉላር ፕሮቲን ኪናሴስ (17፣19) መካከል NMPን በዚህ ጥናት ውስጥ ከዘገብናቸው ሌሎች ፕሮቲኖች ጋር በጋራ ለማገናኘት ለኒራን ተጨማሪ ድጋፍ ይሰጣል።ሊሆኑ የሚችሉ የኒራን ኢላማዎችን ፍለጋ በHCoV-229E ORF1a በተመሰጠሩ ፕሮቲኖች ላይ አተኩረን ነበር፣ እነዚህም በቀጥታም ሆነ በተዘዋዋሪ የRTC ORF1b-encoded ቅጂ (12, 35) ለመርዳት በሚታወቁት ፕሮቲኖች ላይ።የእኛ ሙከራ ውጤታማ እና የተለየ NMPylation ለ nsp9 (ስእል 2) ተጨባጭ ማስረጃዎችን ያቀርባሉ።የታለመው ፕሮቲን ከኤንዛይም (nsp12) ከ 8 እስከ 10 እጥፍ ከፍ ያለ የሞላር ትርፍ ጥቅም ላይ ከዋለ nsp9 ሙሉ በሙሉ (ሞኖ) NMPized (ምስል 4) መሆኑ ተረጋግጧል።በ nsp12 እና nsp9 መካከል ያለው መስተጋብር ለአጭር ጊዜ የሚቆይ እና በ nsp9 (ሌሎች የ RTC ንዑስ ክፍሎች በሌሉበት) የተረጋጋ ውስብስብ ነገር አይፈጥርም ብለን ደመደምን።ይህ መደምደሚያ በ SARS-CoV ፕሮቲን (35) ላይ በፕሮቲን መስተጋብር ጥናቶች የተደገፈ ነው.የኤምኤስ ትንተና የ N-terminal ቀሪዎች የnsp9 ዋና አሚን እንደ NMPylation ጣቢያ (SI አባሪ፣ ምስል S5) ለይቷል።የphosphoramidate ቦንድ እና የኤን-ተርሚናል አሚኖ ቡድን መፈጠር የኒራን-አማላጅ NMPylation እንቅስቃሴን ከ Pseudomonas syringae SelO-mediated AMPylation ምላሽ ይለያል፣ ይህም በሴር፣ ታር፣ ወይም ታይር ቀሪዎች Peptide ላይ የ O-linked AMP መፈጠርን ያረጋግጣል። 22)፣ እና S. typhimurium YdiU O-linked (ከታይር ጋር) እና ኤን-የተገናኘ (ከሱ ጋር) የፔፕታይድ-ዩኤምፒ መግቢያዎችን ይመሰርታሉ።በሴሎ ፕሮቲኖች ቤተሰብ ላይ ያለው ውሱን መረጃ እንደሚያመለክተው የዚህ ትልቅ ፕሮቲን ቤተሰብ አባላት በፔፕታይድ-ኤንኤምፒ ፕሮቲን አፈጣጠር በእጅጉ ይለያያሉ።ይህ ተጨማሪ ጥናት የሚገባው አስደሳች ምልከታ ነው።
በዚህ ጥናት ውስጥ የተገኘው መረጃ የ nsp9 NMPylation ነፃ N-terminus ያስፈልገዋል ብለን እንድንገምት አድርጎናል።በቫይረስ መባዛት አውድ ውስጥ፣ ይህ በMpro እና pp1ab መካከለኛ በሆነው የ polyprotein pp1a በተባዛው የ nsp8|nsp9 ፕሮሰሲንግ ቦታ ፕሮቲዮቲክ ክሊቫጅ ይሰጣል።በአብዛኛዎቹ ኮሮናቫይረስ፣ በዚህ ልዩ ጣቢያ (VKLQ|NNEI በ HCoV-229E) እና በሁሉም ሌሎች የኮሮና ቫይረስ መክተቻ ቦታዎች መካከል ያለው ልዩነት አስን (እንደ Ala፣ Ser or Gly ካሉ ሌሎች ትናንሽ ቅሪቶች ይልቅ) P1' ን ይይዛሉ???አካባቢ (36)በመጀመሪያዎቹ ጥናቶች የተገኘው የፔፕታይድ ክላቭጅ መረጃ እንደሚያሳየው የ nsp8|nsp9 ሳይት የመፍቻ ቅልጥፍና ከሌሎች ድረ-ገጾች ያነሰ ሲሆን ይህም 1) ይህ ልዩ ቦታ የC-terminalን ወቅታዊ የተቀናጀ ሂደት ውስጥ የቁጥጥር ሚና ሊኖረው እንደሚችል ያሳያል። pp1a ክልል፣ ወይም 2) ልዩ የተጠበቀው nsp9 N-terminus በቫይረስ መባዛት ውስጥ ያለው ሚና (37)።የእኛ መረጃ (ምስል 5A) እንደሚያሳየው የ nsp9 recombinant ቅጽ እውነተኛውን የ N-terminal ቅደም ተከተል በመሸከም በ nsp12 በተሳካ ሁኔታ NMPized ተደርጓል።የN-terminal flanking ቅደም ተከተል በፋክተር Xa (nsp9-His6፤ SI አባሪ፣ ሠንጠረዥ S1) ወይም Mpro-mediated cleavage (nsp7-11-His6፤ ምስል 5A እና SI appendix፣ Table S1) ተወግዷል።በአስፈላጊ ሁኔታ, ያልተቆረጠ nsp9-የያዘ precursor nsp7-11-His6 NMPylation መካከል nsp12 የመቋቋም አሳይቷል, ይህም ከእኛ ውሂብ ጋር የሚስማማ, nsp9-NMP adduct በ N-terminal ቀዳሚ አሚን (SI appendix, ምስል S5) በኩል መፈጠሩን ያሳያል. .ስለ NiRAN substrate specificity ጠለቅ ያለ ግንዛቤ ለማግኘት፣ ከዚያም በNSP9 አጠገብ ባለው የN-terminal ቀሪዎች ላይ አተኮርን።ሌሎች ፕሮቲኖች በማይኖሩበት ጊዜ, መዋቅራዊ ተለዋዋጭ ናቸው, ይህም ምልክት በሌለው የ nsp9 (26 28, 38) ውስጥ እንዳይታወቅ ይከላከላል, ይህም ውሱን የተፈጥሮ ልዩነታቸውን የሚያመለክት ነው. የ nsp9 N-terminal ቁርጥራጭ ተግባር.በዚህ ክልል ውስጥ የተጠበቁ ቀሪዎች አላ ምትክ (ምስል 5C እና D እና SI አባሪ ፣ ምስል S8) N3826 ለ nsp9 NMPylation in vitro አስፈላጊ መሆኑን ያሳያል ፣ N3825A እና E3827A ምትክ የ NMPylation ቅነሳን ያስከትላል ፣ M3829A እና P3830A ምትክ .በ nsp9 NMPylation ላይ ተጽዕኖ ያሳድራል።ምንም እንኳን የ N-terminal Asn (N3825A, N3825S) መተካት በ nsp9 NMPylation እና በሕዋስ ባህል ውስጥ የቫይረስ ማባዛት ላይ መጠነኛ ተጽእኖ ቢኖረውም (ምስል 5C እና D) የAsn ቅሪት ቅደም ተከተል ከ N-terminal 3825-NN dipeptide መሰረዝ. ተረጋግጧል ለቫይረሶች ገዳይ ነው፣ ይህም የሚያሳየው በN-terminus ላይ ካለው ሌላ ቅሪት በፊት አንድ የአስኑ ቅሪት እንደሚያስፈልግ፣ በተለይም አስን፣ ምንም እንኳን ተመሳሳይ ቀሪዎችን መተካት በከፊል መታገስ የሚቻል ቢመስልም (ምስል 5B፣ C እና D)።እኛ 3825-NN dipeptide, በተለይ የተጠበቁ እና አስፈላጊ N3826 ኮሮናቫይረስ ክልል ውስጥ ቅሪት (SI አባሪ, ምስል S6) NSP9 N-terminus ያለውን ንቁ ቦታ NiRAN ያለውን ትክክለኛ ትስስር እና አቅጣጫ ያረጋግጣል ብለን መደምደም.
የሁሉም ንዑስ ቤተሰቦች አላ (E3827A) በተጠበቀው ግሉ ውስጥ መተካት nsp9 NMPylation በብልቃጥ ውስጥ ይይዛል ነገር ግን በሴል ባህል ውስጥ ለቫይረሶች ገዳይ ነው (ምስል 5C እና D) የዚህ ቅሪት ተጨማሪ ተግባርን ያሳያል ፣ ለምሳሌ ፣ በቁልፍ ግንኙነቶች (NMPylated ወይም ያልተለወጠ) ) nsp9 N-terminus እና በቫይረስ ማባዛት ውስጥ የተካተቱ ሌሎች ምክንያቶች.የ Nsp9 ሚውቴሽን የ nsp9 ፕሮቲዮቲክ ሂደትን ወይም በአቅራቢያው ያለ ማንኛውም nsps (39) (SI አባሪ ፣ ምስል S9) ላይ ተጽዕኖ አላሳደረም ፣ ይህ የሚያመለክተው የበርካታ nsp9 ሚውቴሽን ገዳይ ፍኖተ ዓይነቶች በ C ፕሮቲዮቲክ ሂደት-ተርሚናል pp1a አካባቢ ዲስኦርደር አለመደረጉን ያሳያል። .
ከላይ ያለው መረጃ በMpro-mediated by the nsp8|9 cleavage site pp1a/pp1ab ውስጥ N-terminus የnsp9 UMPylated (ወይም በከፊል በሌላ NMP) ሊስተካከል እንደሚችል የሚያሳይ ማስረጃ ነው።በተጨማሪም የ nsp9 የ N-terminus እጅግ በጣም ጥሩ ጥበቃ (በኮሮናቫይረስ ቤተሰብ ውስጥ ነጠላ እና የማይለዋወጥ የአስኖ ቅሪቶችን ጨምሮ) እና በዚህ ጥናት ውስጥ የተገኘው የተገላቢጦሽ የጄኔቲክስ መረጃ (ምስል 3E እና 5D) የተገለጸው nsp9 NMPylation እንድንደመድም አድርጎናል። ከባዮሎጂ ጋር የተያያዘ እና ለኮሮና ቫይረስ መባዛት አስፈላጊ ነው።የዚህ ማሻሻያ ተግባራዊ መዘዞች ለምሳሌ ቀደም ሲል የተገለጸውን (የተለየ ያልሆነ) nsp9 (ያልተለወጠ ቅጽ) አር ኤን ኤ ማሰሪያ እንቅስቃሴን (2628) በተመለከተ ለመጠና ይቀራል።N-terminal NMPylation እንዲሁ የ nsp9 ከፕሮቲን ወይም አር ኤን ኤ ንኡስ ንኡስ መስተጋብር ወይም የተለያዩ ባለአራት-ደረጃ ስብሰባዎች መፈጠር ላይ ተጽእኖ ሊያሳድር ይችላል።እነዚህ በመዋቅር ጥናቶች ውስጥ የተስተዋሉ እና ከኮሮቫቫይረስ ማባዛት ጋር በተግባራዊነት የተረጋገጡ ናቸው ፣ ምንም እንኳን በተለይም የዚህ ማሻሻያ ሁኔታ (26-ââ29, 40) በማይኖርበት ጊዜ።
ምንም እንኳን የኮሮና ቫይረስ ኒራን ጎራ ዒላማው ዝርዝር ሁኔታ አሁንም በበለጠ ዝርዝር መገለጽ ያለበት ቢሆንም፣ የእኛ መረጃ እንደሚያሳየው የኮሮና ቫይረስ ኒራን ጎራ የፕሮቲን ኢላማ ዝርዝር ሁኔታ በጣም ጠባብ ነው።ምንም እንኳን በሁሉም የኒዶቫይረስ ቤተሰቦች በኒራን ጎራ ውስጥ ያሉ ቁልፍ ንቁ የሳይት ቅሪቶች (8፣16) ጥበቃ ጥበቃ የሚደረግለት NMPylator የእነዚህን ፕሮቲኖች እንቅስቃሴ አጥብቆ የሚደግፍ ቢሆንም የዚህ ጎራ substrate አስገዳጅ የኪስ ቀሪዎች ማንነት ጥበቃ እና ጥበቃ ተለይቶ የሚታወቅ ቢሆንም። , እና በተለያዩ የኒዶቪራሌስ ዓላማዎች ቤተሰቦች መካከል ሊለያይ ይችላል.በተመሳሳይ፣ የሌሎች የጎጆ ቫይረሶች አግባብነት ያላቸው ኢላማዎች ገና አልተወሰኑም።የ nsp9 ወይም ሌሎች ፕሮቲኖች የርቀት ኦርቶሎጎች ሊሆኑ ይችላሉ፣ ምክንያቱም በአጠቃላይ በጎጆ ቫይረሶች ውስጥ የሚቀመጡት ከአምስቱ የተባዛ ጎራዎች ውጭ ያሉት ቅደም ተከተሎች ብዙም የተጠበቁ አይደሉም (8)፣ በ Mpro እና NiRAN መካከል ያለውን የጂኖም ድርድር ጨምሮ፣ ከነሱ መካከል nsp9 የሚገኘው በ ኮሮናቫይረስ.
በተጨማሪም፣ በአሁኑ ጊዜ የኒራን ጎራ ተጨማሪ (ሴሉላርን ጨምሮ) ኢላማዎች አሉት የሚለውን ማስቀረት አንችልም።በዚህ ሁኔታ ውስጥ, በዚህ ብቅ ፕሮቲን NMPylators (NMPylators) (30, 31) ውስጥ የባክቴሪያ homologues "ዋና ተቆጣጣሪዎች" ያላቸው ይመስላል መሆኑን መጥቀስ ተገቢ ነው?ኤንኤምፒ የተለያዩ ሴሉላር ፕሮቲኖችን ያስተካክላል የታችኛው ተፋሰስ ተግባራቶቻቸውን ለመቆጣጠር ወይም ለማጥፋት፣በዚህም በተለያዩ ባዮሎጂያዊ ሂደቶች ውስጥ ሚና ይጫወታል፣እንደ ሴሉላር ውጥረት ምላሽ እና redox homeostasis (22, 33)።
በዚህ ጥናት (ምስል 2 እና 4 እና SI አባሪ ፣ ሥዕሎች S3 እና S5) ፣ nsp12 የ UMP (NMP) ክፍልን በ nsp9 ውስጥ ወደ አንድ (የተጠበቀ) ቦታ እንዳስተላልፍ ማረጋገጥ ችለናል ፣ ሌሎች ፕሮቲኖች ግን አልተሻሻሉም ። ጥቅም ላይ የዋለው በሁኔታዎች ውስጥ በደንብ የተገለጸ (ከላጣው) የንዑስ ክፍል ልዩነት ይደገፋል።ከዚህ ጋር በሚስማማ መልኩ፣ ከN-terminal nsp9 NMPylation ጋር ሲነጻጸር፣ የ nsp12 የራሱ NMPylation እንቅስቃሴ በጣም ዝቅተኛ ነው፣ ፍለጋው ረዘም ያለ የአውቶራዲዮግራፊ ተጋላጭነት ጊዜን ይፈልጋል፣ እና የ nsp12 ትኩረትን በ10 እጥፍ ይጨምራል።በተጨማሪም፣ የእኛ የኤምኤስ ትንታኔ ለNMPylation የ nsp12 ማስረጃ ማቅረብ አልቻለም፣ ይህም የኒራን ጎራ ራስን-NMPylation (በምርጥ) ሁለተኛ ደረጃ እንቅስቃሴ መሆኑን ይጠቁማል።ነገር ግን፣ ሌሎች ጥናቶች የባክቴሪያ ኤንኤምፒላይተር ራስን መቻል ሁኔታ በሌሎች የፕሮቲን ንጥረ ነገሮች (22, 33) ላይ የ NMPylation እንቅስቃሴን ሊቆጣጠር እንደሚችል የመጀመሪያ ማስረጃዎችን እንዳቀረቡ ልብ ሊባል ይገባል።ስለዚህ፣ ለ EAV nsp9 (16) እና ለኮሮና ቫይረስ nsp12 (ይህ ጥናት) በ C-terminal RdRp ጎራ መታጠፍ ላይ የታቀደውን የቻፔሮን መሰል ተጽእኖን ጨምሮ የራስን ኤንኤምፒየላሽን እንቅስቃሴዎች ሊያስከትሉ የሚችሉትን ተግባራዊ ውጤቶች ለመመርመር ተጨማሪ ምርምር ያስፈልጋል። 16))።
ከዚህ ቀደም የኒዶቫይራል ኒራን ጎራ የታችኛው ተፋሰስ ተግባራትን የሚመለከቱ በርካታ መላምቶች አር ኤን ኤ ሊጋሴን፣ አር ኤን ኤ - ካፕድ ጓንላይት ዝውውር እና የፕሮቲን ፕሪሚንግ እንቅስቃሴን (16) ጨምሮ፣ ነገር ግን አንዳቸውም ቢሆኑ ከሚገኙ የታችኛው ተፋሰስ ተግባራት ጋር የሚጣጣሙ አይደሉም።ተጨማሪ ግምቶችን ሳያደርጉ በሚከተሉት ቦታዎች የተገኘው መረጃ በትክክል ተመሳሳይ ጊዜ ነው.በዚህ ጥናት ውስጥ የተገኘው መረጃ የኒራን ጎራ በፕሮቲን የተደገፈ አር ኤን ኤ ውህደትን በመጀመር ላይ መሳተፉን (ነገር ግን ማረጋገጥ አይቻልም) በጣም የሚስማማ ነው።ቀደም ሲል የኒራን ጎራ ተግባር በ 5 ??²-አር ኤን ኤ ካፕ ወይም አር ኤን ኤ ligation ምላሽ በእነዚህ እና የሌላ ውሂብ ድጋፍ አይነካም።ስለዚህ፣ ለምሳሌ፣ የኒራን ገባሪ ቦታ የተጠበቀውን አስፕ እንደ አጠቃላይ መሰረት እንደሚያጠቃልል ይቆጠራል (D252 በ Pseudomonas syringae SelO፣ D4271 በ HCoV-229E pp1ab ውስጥ፣ D208 በ SARS-CoV-2 nsp12) (SI አባሪ፣ ምስል 2) ).S2) (17, 22, 33), በ ATP-ጥገኛ አር ኤን ኤ ሊጋሴ እና አር ኤን ኤ ካፒንግ ኢንዛይም ውስጥ ያለው ካታሊሲስ በ covalent ኤንዛይም (lysyl-N) -ኤንኤምፒ መካከለኛ ሲሆን ይህም ያልተለወጠ የሊስ ቀሪዎችን ያካትታል ( 41)በተጨማሪም፣ አስደናቂው በቅደም ተከተል ላይ የተመሰረተ የኮሮና ቫይረስ ኒRANን ለተጠበቁ የፕሮቲን ኢላማዎች እና ለኤንቲፒ ተባባሪዎች (UTP ይመርጣል) ዘና ያለው ልዩነት በኒራን-መካከለኛ የካፒንግ ኢንዛይም ወይም አር ኤን ኤ ሊጋዝ መሰል ተግባራትን ይቃወማል።
በግልጽ ለማየት እንደሚቻለው ፣ ለማረጋገጥ እና ከተረጋገጠ ፣ nsp9-UMP (nsp9-NMP) በፕሮቲን-የተመረተ አር ኤን ኤ ውህደት ውስጥ ሊኖረው የሚችለውን ሚና የበለጠ ለማብራራት ብዙ አስደሳች ነገር ግን (እስካሁን) ቀደም ሲል የተዘገበ ሪፖርቶችን ያገናኛል ። .ገለልተኛ ምልከታዎች።ለምሳሌ፣ የኮሮናቫይረስ አሉታዊ-ክር አር ኤን ኤ መጨረሻ የሚጀምረው በ oligo(U) strand (42፣ 43) እንደሆነ ተወስኗል።ይህ ምልከታ የአሉታዊ-ክር አር ኤን ኤ ውህደት የጀመረው UMPylated form of nsp9 ን ከፖሊ(A) ጅራት (ቀስቅሴዎች) ጋር በማያያዝ ነው ከሚለው ሀሳብ ጋር የሚስማማ ሲሆን ይህም በአር ኤን ኤ ትስስር ሊበረታታ ይችላል እንቅስቃሴ እና/ወይም ከ ጋር ያለው መስተጋብር። ሌላ RTC ፕሮቲን.በ nsp9 የቀረበው የ UMP ክፍል ለ nsp7/8/nsp12-mediated oligouridylation እንደ “primer” ሆኖ 3??²-ፖሊ(A) ጅራቱን በጂኖሚክ አር ኤን ኤ ወይም ሌላ ኦሊጎ (A) የያዘውን ቅደም ተከተል በመጠቀም ሊያገለግል ይችላል። ለ picornavirus VPg ፕሮቲን (44) ከተቋቋመው ዘዴ ጋር ተመሳሳይነት እንደ አብነት ያገለግላል።ሃሳቡ "መደበኛ ያልሆነ" ከሆነስ????የ (ፕሮቲን-የተፈጠረ) አሉታዊ-ክር አር ኤን ኤ ውህደት መነሳሳት ምልከታዎችን የሚያገናኝ ሲሆን ይህም የኮሮና ቫይረስ አሉታዊ-ክር አር ኤን ኤ በመጨረሻው (42) ላይ UMP (ከ UTP) እንዳለው ያሳያል ። ኑክሊክ አሲድ Dicer ባልታወቀ ዩሪዲን-ተኮር ኤንዶኑክሊዝ የተፈጠረ ፎስፎሪላይት መጨረሻን ይሰፋል።ከተረጋገጠ፣ ይህ ኑክሊክ አሲድ ሃይድሮሊቲክ እንቅስቃሴ ኦሊጎሜሪክ UMPylated nsp9ን ከ 5 ² ጫፍ ጫፍ አሉታዊውን ገመድ ለመልቀቅ ይረዳል።Nsp9 (እና nsp8) በኮሮና ቫይረስ ጂኖም 3 ጫፍ አቅራቢያ ከተጠበቀው cis-action አር ኤን ኤ ኤለመንት ጋር በወሳኝነት እንደሚገናኙ ባረጋገጡት ከቀደምት የተገላቢጦሽ የጄኔቲክስ ጥናቶች ጋር የ nsp9 በፕሮቲን ፕሪሚንግ ውስጥ ያለው ሚና ተመሳሳይ ነው።45)በዚህ ዘገባ መሰረት እነዚህ ቀደምት ምልከታዎች አሁን እንደገና ሊፈተሹ እና ተጨማሪ ምርምር ሊደረጉ ይችላሉ.
በማጠቃለያው የኛ መረጃ ከRdRp ጋር የተገናኘ የባለቤትነት ጎጆ ቫይረስ ኢንዛይም መለያ በN-terminus ላይ ያለውን ልዩ እንቅስቃሴ ወስኗል።በኮሮና ቫይረስ ውስጥ፣ ይህ አዲስ የተገኘ የኒራን-አማላጅ UMPylator/NMPylator እንቅስቃሴ በMn2+ እና በአጎራባች የአስኖ ቅሪቶች ላይ ለመመካት እና ከኤን-ተርሚናል የመጀመሪያ ደረጃ አሚን ጋር (አነስተኛ ኃይል ያለው) ፎስፎራሚድ ቦንድ እንዲፈጠር ለማድረግ ይጠቅማል።በMpro-mediated cleavage በ nsp8|9 የመክፈያ ቦታ የnsp9 ኢላማ ለNMPylation ጥቅም ላይ ሊውል ይችላል፣ ይህም በፕሮቲኤዝ እና በኒራን ጎራ መካከል ያለውን ተግባራዊ ትስስር ያሳያል፣ ይህም እስከ RdRp ይደርሳል።በ nsp12 ኒራን አክቲቭ ሳይት ውስጥ ያሉ የቁልፍ ቅሪቶች ጥበቃ እና የ nsp9 ኢላማ ፣ SARS-CoV-2 ን ጨምሮ ከሁለት ኮሮናቫይረስ ከተገኘው መረጃ ጋር ተዳምሮ nsp9 NMPylation የኮሮና ቫይረስ ወግ አጥባቂ ባህሪያትም የቫይረስ መባዛት ቁልፍ እርምጃ መሆናቸውን የሚያሳይ ጠንካራ ማስረጃ ነው።ያለው መረጃ የ NMPylated ቅጽ nsp9 ልዩ ሚና በፕሮቲን-የተመረተ አር ኤን ኤ ውህደት ውስጥ ያለው ሚና ለኮሮናቫይረስ እና ለሌሎች ጎጆ ቫይረሶች ምክንያታዊ ሁኔታ ነው፣ እና ኒራን ሌሎች ያልታወቁ ፕሮቲኖችንም ሊያጠቃ ይችላል።ቫይረሱን መቆጣጠር.የአስተናጋጅ መስተጋብር.ከተረጋገጠ፣ የፕሮቲን ፕሪመርሮች በቫይረስ አር ኤን ኤ ውህደት ውስጥ መሳተፉ የኤምፕሮ/3CLpro እና RdRp ጎራዎች ቀደም ሲል በተገኘው ኮሮናቫይረስ እና ፒኮርናቫይረስ መሰል ሱፐር ቡድን (9) መካከል ያለውን ትስስር ይጨምራል፣ ይህም አሁን በቅርቡ በተቋቋመው ፒሶኒቪራይትስ (Pisonivirites) ውስጥ አንድ ሆነዋል። 46) በምድብ.
በዚህ ጥናት ውስጥ ተለይተው የሚታወቁት መሰረታዊ፣ መራጭ እና ወግ አጥባቂ የኢንዛይም ተግባራት ለፀረ-ቫይረስ መድሃኒቶች ኢላማ ሆነው እንደሚገኙም መረጃዎቻችን ያሳያሉ።በኒራን ንቁ ቦታ ላይ ያለውን የ nsp9 N-terminus ትስስርን (እና በቀጣይ ማሻሻያ) የሚያስተጓጉሉ ውህዶች ውጤታማ እና ሁለገብ የፀረ-ቫይረስ መድሐኒቶች ሊሆኑ ይችላሉ ፣ ይህም ከተለያዩ (ንዑስ) ጂነስ ኢንፌክሽኖች የሚመጡ የእንስሳት እና የሰው ኮሮናቫይረስን ለማከም ተስማሚ። SARS-CoV-2 እና መካከለኛው ምስራቅ የመተንፈሻ ሲንድሮም ኮሮናቫይረስን ጨምሮ።
በዚህ ጥናት ውስጥ የሚመረተው የኮሮና ቫይረስ ፕሮቲን ኮድ ቅደም ተከተል በ RT-PCR የተጨመረው አር ኤን ኤ ከHuh-7 በHCoV-229E ወይም በ SARS-CoV-2 የተበከለውን እና መደበኛ የክሎኒንግ ሂደቶችን በመጠቀም የገባውን ቬሮ ኢ6 በመጠቀም ነው።pMAL-c2 (ኒው ኢንግላንድ ባዮሎጂካል ላብራቶሪ) ወይም pASK3-Ub-CHis6 (47) አገላለጽ ቬክተር (SI አባሪ፣ ሰንጠረዦች S1 እና S2)።ነጠላ ኮዶን መተኪያዎች በ PCR ላይ የተመሰረተ ሳይት ላይ የተመሰረተ ሙታጄኔሲስ (48) አስተዋውቀዋል።የኤምቢፒ ውህደት ፕሮቲን ለማምረት፣ ኢ.ኮሊ ቲቢ1 ሴሎች በተገቢው የ pMAL-c2 ፕላዝማድ ግንባታ (SI አባሪ፣ ሠንጠረዥ S1) ተለውጠዋል።የውህደቱ ፕሮቲን በአሚሎዝ አፊኒቲ ክሮማቶግራፊ የጸዳ እና በፋክተር Xa ተሰንጥቆ ነበር።በመቀጠል፣ የC-terminal His6-tagged ፕሮቲን ቀደም ሲል እንደተገለጸው በኒ-አይሞቢልዝድ የብረት አፊኒቲ ክሮሞግራፊ (Ni-IMAC) ተጠርጓል።የ ubiquitin ፊውዥን ፕሮቲን ለማምረት፣ E.coli TB1 ሕዋሳት ተገቢውን የ pASK3-Ub-CHis6 ፕላዝማድ ግንባታ (SI አባሪ፣ ሰንጠረዦች S1 እና S2) እና pCGI ፕላዝማይድ ዲ ኤን ኤ ኢንኮዲንግ ubiquitin-specific C-terminal hydrolase 1 (Ubp1) ተጠቅመዋል።ለውጥ (47)የ C-terminal His6 መለያ የተደረገበት የኮሮና ቫይረስ ፕሮቲን ቀደም ሲል እንደተገለፀው ተጠርጓል (50)።
የHCoV-229E nsp12-His6 የራስ-NMPylation ሙከራ የተካሄደው በEAV nsp9 (16) ላይ እንደተገለጸው ነው።በአጭሩ, nsp12-His6 (0.5 µM) 50 ሚሜ 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic አሲድ (HEPES) -KOH, pH 8.0, 5 mM dithiothreitol (DTT), 6 mM MnCl2, 25 µM ቋት ይዟል. የተገለጸው ኤንቲፒ እና 0.17 µM ከ[α32-P] NTP (3,000 Ci/mmol፤ Hartmann Analytic) በ30 ዲግሪ ሴንቲግሬድ ለ30 ደቂቃዎች ተዛምዷል።በሁሉም ሌሎች (መደበኛ) NMPylation የ nsp12-mediated nsp9 NMPylation, የምላሽ ሁኔታዎች እንደሚከተለው ተስተካክለዋል-nsp12-His6 (0.05 µM) እና nsp9-His6 (4 µM) በ 50 ሚሜ HEPES-KOH (pH 8.0) ፊት. )፣ 5 ሚሜ ዲቲቲ፣ 1 ሚሜ ኤምኤንሲል2፣ 25 µM NTP አመልክቷል፣ እና 0.17 µM [α32-P] NTP።ለ 10 ደቂቃዎች በ 30 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ ከጨመረ በኋላ, የምላሽ ናሙና ከ SDS-PAGE ናሙና ቋት ጋር ተቀላቅሏል: 62.5 mM tris (hydroxymethyl)aminomethane HCl (pH 6.8), 100 mM DTT, 2.5% SDS, 10% glycerol እና 0.005% bromophen ሰማያዊ.ፕሮቲኑ በ 90 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ለ 5 ደቂቃዎች በማሞቅ እና በ 12% SDS-PAGE ተከፍሏል.ጄል ተስተካክሏል እና በCoomassie Brilliant Blue መፍትሄ (40% ሜታኖል፣ 10% አሴቲክ አሲድ፣ 0.05% Coomassie Brilliant Blue R-250)፣ ቀለም ተለውጧል እና ለ20 ሰአታት ለፎስፈረስ ኢሜጂንግ ስክሪን ተጋልጧል (nsp12 ከ NMPylation ለማወቅ) ወይም (ከፍተኛ) 2 ሰዓታት (nsp9 NMPylation ለመገምገም)።የTyphoon 9200 imager (GE Healthcare) ስክሪኑን ለመቃኘት ጥቅም ላይ ውሎ ነበር እና ImageJ የምልክቱን መጠን ለመተንተን ጥቅም ላይ ውሏል።
ለኤምኤስ ትንተና፣ 1 µM nsp12-His6 እና 10 µM nsp9 (ያለ ሄክሳሂስቲዲን መለያ) በNMPylation ትንተና (SI appendix፣ Table S1) እና የ500 µM UTP እና GTP ትኩረትን ይጨምራል።እንደ ትኩረታቸው እና የሚጠበቀው የፕሮቲን ጥራታቸው፣ የWaters ACQUITY H-Class HPLC ስርዓት MassPrep አምድ (ውሃዎች) ያለው ከ1 እስከ 10 µL የታሸጉ የፕሮቲን መፍትሄዎችን በመስመር ላይ ለማጥፋት ጥቅም ላይ ውሏል።የተቀነሰው ፕሮቲን ወደ ኤሌክትሮስፕሬይ ion ምንጭ ሲናፕት G2Si mass spectrometer (ውሃዎች) በሚከተለው ቋት A (ውሃ/0.05% ፎርሚክ አሲድ) እና ቋት ቢ (አሴቶኒትሪል/0.045% ፎርሚክ አሲድ) በኩል ይወጣል እና የአምዱ ሙቀት ነው። 60 ° ሴ እና የ 0.1 ሚሊ ሊትር የፍሰት መጠን፡- ኢሉቴሽን አይዞክራሲያዊ በሆነ መልኩ ከ 5% A ለ 2 ደቂቃዎች, ከዚያም በ 8 ደቂቃ ውስጥ ወደ 95% B ወደ መስመራዊ ቅልመት እና 95% B ለሌላ 4 ደቂቃዎች ይቆዩ.
ከ 500 እስከ 5000 ሜ / ዜር ያለው የጅምላ መጠን ያላቸው አዎንታዊ ionዎች ተገኝተዋል.ለራስ-ሰር የጅምላ ተንሸራታች እርማት ግሉ-ፋይብሪኖፔፕታይድ ቢ በየ45 ሰከንድ ይለካል።የመነሻ መስመሩን ከተቀነሱ እና ከተስተካከለ በኋላ አማካዩን ስፔክትረም ለማራገፍ የ MassLynx መሣሪያ ሶፍትዌር ከ MaxEnt1 ቅጥያ ጋር ይጠቀሙ።
UMPylated HCoV-229E nsp9 የተፈጨው በቅደም ተከተል ደረጃ የተቀየረ ትራይፕሲን (ሰርቫ) በመጨመር በአንድ ሌሊት በ 37 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ነው።የ Chromabond C18WP ስፒን አምድ (የክፍል ቁጥር 730522፤ ማቸሬይ-ናጌል) ፔፕቲድዶችን ለማቅለጥ እና ለማተኮር ያገለግል ነበር።በመጨረሻም, peptide 5% አሴቶኒትሪል እና 0.1% ፎርሚክ አሲድ የያዘው በ25µL ውሃ ውስጥ ተሟጧል።
ናሙናዎቹ በ MS የተተነተነው Orbitrap Velos Pro mass spectrometer (Thermo Scientific) በመጠቀም ነው።የመጨረሻው ናኖ የ HPLC ስርዓት (Dionex), በብጁ መጨረሻ የተገጠመ 50 ሴ.ሜ ??75 μm C18 RP አምድ በ 2.4 μm መግነጢሳዊ ዶቃዎች (ዶክተር አልቢን ማይሽ ከፍተኛ አፈፃፀም LC GmbH) በፕሮክሰዮን ናኖስፕራይ ምንጭ በኩል በመስመር ላይ ካለው የጅምላ ስፔክትሮሜትር ጋር ይገናኙ;6 µL ትራይፕሲን መፈጨት መፍትሄ በ 300 µm ውስጣዊ ዲያሜትር ውስጥ ያስገቡ × ??1 ሴ.ሜ C18 የፔፕማፕ ቅድመ-ማጎሪያ አምድ (ቴርሞ ሳይንቲፊክ)።ውሃ/0.05% ፎርሚክ አሲድ እንደ ሟሟ በመጠቀም፣ ናሙናው በራስ-ሰር ተይዞ በ6 µL/ደቂቃ በሚፈስበት ጊዜ ጨዋማ ተደረገ።
የሚከተሉት የውሃ / 0.05% ፎርሚክ አሲድ (ሟሟት ኤ) እና 80% አሴቶኒትሪል / 0.045% ፎርሚክ አሲድ (የሟሟ B) በ 300 nL / ደቂቃ ፍሰት መጠን የ tryptic peptides መለያየትን ለማሳካት ጥቅም ላይ ይውላሉ: 4% B ለ 5 ደቂቃ፣ ከዚያ 30 A መስመራዊ ቅልመት ወደ 45% B በደቂቃዎች ውስጥ፣ እና የመስመር ጭማሪ በ5 ደቂቃ ውስጥ ወደ 95% ሟሟ ቢ።የክሮማቶግራፊን አምድ ከማይዝግ ብረት ናኖ-ኤሚተር (ፕሮክሰዮን) ጋር ያገናኙ እና 2,300 ቮ አቅም በመጠቀም ኤሉኤትን በቀጥታ ወደ ሞቃት የጅምላ ስፔክትሮሜትር ይረጩ። ቢያንስ በሶስት ዳታ ኤምኤስ/ኤምኤስ ስካን፣ በተለዋዋጭ ሁኔታ ለ30 ሰከንድ የተገለለ፣ ሊኒያር ion ወጥመድ ግጭትን የሚፈጥር መለያየትን በመጠቀም ወይም ከፍ ያለ የኢነርጂ ግጭት መለያየትን በመጠቀም ከኦርቢትራፕ ማወቂያ ጋር ተጣምሮ፣ ጥራቱ 7,500 ነው።
የልጥፍ ሰዓት፡- ኦገስት-03-2021